Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

ANTIOXIDANTS EFFECT ON THE GROWTH OF THE CULTURE OF ESCHERICHIA COLI AND SENSITIVITY TO GENTAMICIN

Miroshnichenko A.G. 1 Bryukhanov V.M. 1 Butakova L.Y. 1 Gossen I.E. 1 Perfilyev V.Y. 1 Smirnov P.V. 1
1 Altai state medical university
Studied the effect of antioxidants (reduced glutathione, ascorbic acid, N-acetylcysteine, methylethylpyridinol) at concentrations of 0.5, 1, 2, and 4 mM for the growth of the strain Escherichia coli ATCC25922 and its sensitivity to gentamicin. Incubation and dynamic monitoring of the development of strains were performed within 24 hours. Found that reduced glutathione concentrations 0,25–0,5 mM stimulates the growth of bacteria, but at concentrations of 2 and 4 mM has a depressing effect. Ascorbic acid, N-acetylcysteine ​​and methylethylpyridinol have a weak antibacterial action, and the severity of the effect depends on the concentration of antioxidant. All studied antioxidants cause a reduction in sensitivity of the studied strains to gentamicin. Particularly strong activity of gentamicin reduces methylethylpyridinol. These data should be considered when using gentamicin for infections caused by Escherichia coli.
antioxidants
gentamicin
ascorbic acid
N-acetylcysteine
methylethylpyridinol
bacterium
Escherichia coli
1. Zajcev A.A., Sinopal’nikov A.I. Aminoglikozidy s pozicij sovremennoj praktiki lechenija infekcij dyhatel’nyh putej // Lechashhij vrach. 2009. no. 9. pp. 18–25.
2. Krasnov M.V., Krasnov V.M. Sepsis u detej rannego vozrasta: sovremennye kriterii diagnoza i principy lechenija // Prakticheskaja medicina. 2010. no. 40. pp. 28–39.
3. Lakin G.F. Biometrija: Ucheb. posobie dlja biol. spec. vuzov. 4-e izd., pererab. i dop. M.: Vyssh. shk., 1990. 352 p.
4. Rachina S.A. Fokin A.A., Ishmuhametov A.A., Denisova M.N. Analiz ambulatornogo potreblenija antimikrobnyh preparatov dlja sistemnogo primenenija v razlichnyh regionah RF // Klin. Mikrobiol. Antimikrob. Himioter. 2008. T. 10. no. 1. pp. 59–69.
5. Reshed’ko G.K. Aminoglikozidy: perspektivy klinicheskogo ispol’zovanija v stacionarah Rossii // Klin. Mikrobiol. Antimikrob. Himioter. 2008. T. 10. no. 3. pp. 260–269.
6. Reshed’ko G.K., Rjabkova E.L., Krechikova O.I., Suhorukova M.V., Shevchenko O.V., Jejdel’shtejn M.V. Rezistentnost’ k antibiotikam gramotricatel’nyh vozbuditelej nozokomial’nyh infekcij v ORIT mnogoprofil’nyh stacionarov Rossii // Klin. Mikrobiol. Antimikrob. Himioter. 2008. T. 10. no. 2. pp. 163–179.
7. Bisi-Johnson M.A., Obi C.L. Escherichia coli and Salmonella species: molecular landscape and therapeutic considerations: a review // J. Med. Sci. Adv. 2012. Vol. 1(1). pp. 1–16.
8. Kohanski M.A., Dwyer D.J., Wierzbowski J., Cottarel G., Collins J.J. Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death // Cell. 2008. Vol. 135. pp. 679–690.
9. Kosowera N.S., Vanderhoffa G.A., Kosowerb E.M. Glutathione VIII. The effect of glutathione disulfide on initiation of protein synthesis // Biochim. Biophys. Acta. 1961. Vol. 49. pp. 235–236.
10. Piccolomini R., Ilio C.D., Aceto A., Allocati N., Faraone A., Cellini L., Ravagnan G., Federici G. Glutathione transferase in bacteria: subunit composition and antigenic characterization // J. Gen. Microbiol. 1989. Vol. 135. pp. 3119–3125.
11. Rawat M., Newton G.L., Ko M., Martinez G.J., Fahey R.C., Av-Gay Y. Mycothiol-deficient Mycobacterium smegmatis mutants are hypersensitive to alkylating agents, free radicals, and antibiotics // Antimicrob. Agents Chemother. 2002. Vol. 46. pp. 3348–3355.
12. Vuilleumier S. Bacterial glutathione S-transferases: what are they good for? // J. Bacteriol. 1997. Vol. 179. pp. 1431–1441.

Распространение заболеваний, вызываемых резистентными к действию антибиотиков бактериями, требует совершенствования способов лечения соответствующих больных, а также вызывает необходимость изучения факторов формирования антибиотикорезистентности и методов ее преодоления [5]. Одними из широко применяемых в настоящее время антибиотиков являются аминогликозиды, входящие в перечень препаратов первого ряда при сепсисе и ряде других инфекционных заболеваний [1, 2]. Аминогликозиды наряду с карбапенемами и ингибиторозащищенными цефалоспоринами относятся к препаратам, применяемым для лечения инфекционных заболеваний, вызванных Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., а также представителями семейства Enterobacteriaceae [6]. Нерациональное использование аминогликозидов в течение длительного времени привело к широкому распространению резистентных штаммов, затрудняющему проведение эффективной фармакотерапии с использованием этого класса антибиотиков. В Российской Федерации уровень резистентности к аминогликозидам (прежде всего к гентамицину) превышает таковой по сравнению с большинством развитых стран [4].

Хотя кишечная палочка является основным представителем нормальной микрофлоры толстого кишечника человека, она способна вызывать широкий спектр инфекционных заболеваний – кишечных инфекции, неонатального менингита, пневмонии, инфекций мочевыводящих путей, холецистита, бактериемии. Кроме того, Escherichia coli может являться причиной септического артрита, эндофтальмита, гнойного тиреоидита, синусита, остеомиелита, эндокардита, инфекций кожи и мягких тканей; 12–50 % внутрибольничных инфекций и 4 % случаев кишечных инфекций вызывается кишечной палочкой [7].

В связи с признанием универсальной роли усиления процессов свободнорадикального окисления в патогенезе различных заболеваний, в т.ч. инфекционных, в качестве вспомогательной терапии больным с бактериальными инфекциями могут назначаться антиоксиданты. Таким образом, в традиционную химиотерапевтическую схему «макроорганизм – антимикробное средство – микроорганизм» включается дополнительное лекарственное вещество, влияние которого на микроорганизм-возбудитель в подавляющем большинстве случаев не учитывается.

Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка влияния некоторых антиоксидантов (восстановленный глутатион, N-ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, метилэтилпиридинол) на развитие штамма Escherichia coli ATCC25922 и его чувствительность к гентамицину.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на штамме Escherichia coli ATCC25922. Из указанного штамма готовили суточные культуры инкубацией на скошенном агаре при 35 °С, которые использовали для приготовления инокулятов – бактериальных суспензий в 0,9 % растворе хлорида натрия с оптической плотностью 1,0 по Мак-Фарланду. Перед инокуляцией методом разведения определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) гентамицина. Для инкубации готовили смесь на основе минеральной питательной среды M9. В первой серии эксперимента в среду добавлялись изучаемые антиоксиданты (восстановленный глутатион, аскорбиновая кислота, N-ацетилцистеин, метилэтилпиридинол) до конечных концентраций 0,25, 0,5, 1, 2 и 4 мМ. Во второй серии помимо антиоксидантов также добавлялся гентамицин до сублетальной концентрации (0,3 мг/л), составляющей 50 % ранее определенной МПК. После инокуляции бактериальной суспензии смесь инкубировали в воздушном термостате при 35 °С в течение 24 часов. Для оценки развития штаммов использовали аппарат для определения оптической плотности бактериальных взвесей Densi-la-meter (Erba Lachema s.r.o., Чехия). Полученные данные сравнивали с данными контрольных инкубационных смесей. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметического критерия Манна–Уитни с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software, Inc., США), различия считали значимыми при P < 0,05 (в табл. 1 и 2 уровень статистической значимости указан в верхнем индексе после значения) [3].

Результаты исследования и их обсуждение

В табл. 1 представлены результаты изучения влияния антиоксидантов на развитие изучаемого штамма. Как видно из представленных данных, лог-фаза развития культуры в заданных условиях начинается между четвертым и восьмым часом эксперимента. На восьмом часу инкубации впервые становится явным значимое пробактериальное действие восстановленного глутатиона в концентрациях 0,25 и 0,5 мМ, сохраняющееся до окончания опыта. В инкубационных смесях, содержащих глутатион в концентрации 1 мМ, значимое повышение оптической плотности бактериальной биомассы по сравнению с контролем отмечается лишь через восемь и через двенадцать часов. С дальнейшим увеличением концентрации глутатиона пробактериальный эффект антиоксиданта сменяется на антибактериальный. Так, к 24 часу инкубации оптическая плотность бактериальной суспензии, содержащей глутатион в концентрации 4 мМ, ниже контрольной на 9 %. Глутатион является естественным метаболитом кишечной палочки, и, следовательно, может использоваться в обмене веществ. Однако высокие концентрации глутатиона оказываются токсичными для бактерии, что, по-видимому, объясняется нарушением окислительно-восстановительных процессов. Похожим влиянием на рост бактериальной культуры обладает аскорбиновая кислота. По сравнению с глутатионом в минимальных концентрациях она не вызывает ни эпизодического, ни закономерного усиления развития штамма.

N-ацетилцистеин, являясь, как и глутатион, носителем активных сульфгидрильных групп, обладает слабо выраженным влиянием на развитие кишечной палочки. Слабое, но статистически значимое повышение оптической плотности бактериальных суспензий к 24 часу инкубации наблюдается в присутствии N-ацетилцистеина в концентрациях 0,5–2 мМ.

Выраженным антибактериальным действием обладает метилэтилпиридинол. Закономерное угнетение развития культуры Escherichia coli, степень которого прямо пропорциональна концентрации антиоксиданта, наблюдается с восьмого часа инкубации. К окончанию эксперимента оптическая плотность инкубационной смеси, содержащей метилэтилпиридинол в наибольшей концентрации (4 мМ), значимо меньше контрольной на 19,5 %.

Из табл. 2 видно, что все изучаемые антиоксиданты ослабляют антибактериальное действие гентамицина. Эффект носит явную прямо пропорциональную зависимость от концентрации каждого из антиоксидантов в инкубационной среде. Особенно выраженной антагонистической активностью по отношению к гентамицину обладает метилэтилпиридинол, который, как описано выше, обладает антибактериальной активностью.

Одним из возможных механизмов снижения чувствительности к гентамицину под действием тиоловых антиоксидантов (глутатион, N-ацетилцистеин) может быть биотрансформация антибактериального средства при участии глутатион-S-трансферазы, в результате которой в бактериальных клетках образуются конъюгаты антиоксидантов и гентамицина [10, 12]. Но гентамицин не содержит активных электрофильных групп, поэтому, вероятно, реакции конъюгации подвергается продукт N-ацетилирования антибиотика. Описанный механизм подтверждается на примере бактерий Mycobacterium smegmatis, которые синтезируют аналог глутатиона микотиол, и микотиол-дефицитные штаммы микроорганизма проявляют гиперчувствительность к антибактериальным средствам [11].

Таблица 1

Влияние аскорбиновой кислоты на развитие культуры Escherichia coli ATCC25922

Концентрация антиоксиданта

Оптическая плотность бактериальной биомассы, Me(25 %;75 %)P,усл. ед. по Мак-Фарланду

4 часа

8 часов

12 часов

24 часа

0 (контроль)

0,3(0,3;0,4)

2,6(2,6;2,9)

4,3(4,2;4,3)

4,1(4,1;4,2)

Восстановленный глутатион

0,25 мМ

0,4(0,3;0,4)0,313

3,1(3,0;3,2)0,035

4,5(4,4;4,6)0,010

4,4(4,2;4,4)0,021

0,5 мМ

0,3(0,3;0,4)0,765

3,1(3,0;3,1)0,040

4,6(4,5;4,7)0,002

4,4(4,4;4,4)0,002

1 мМ

0,4(0,4;0,4)0,011

3,0(3,0;3,0)0,061

4,6(4,5;4,6)0,003

4,2(4,2;4,3)0,067

2 мМ

0,3(0,3;0,4)0,765

2,4(2,4;2,4)0,003

4,5(4,4;4,5)0,004

4,0(3,9;4,0)0,010

4 мМ

0,4(0,4;0,4)0,090

1,8(1,7;2,0)0,002

3,9(3,9;3,9)0,002

3,7(3,6;3,8)0,002

Аскорбиновая кислота

0,25 мМ

0,3(0,3;0,3)0,750

2,6(2,6;2,7)0,795

4,3(4,3;4,3)0,946

4,2(4,1;4,2)0,342

0,5 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,4(2,4;2,4)0,003

4,2(4,2;4,3)0,384

4,1(4,1;4,1)0,162

1 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,6(2,5;2,6)0,143

4,2(4,2;4,2)0,042

4,0(4,0;4,1)0,134

2 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,3(2,3;2,3)0,003

4,2(4,1;4,2)0,016

4,0(3,9;4,0)0,010

4 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,4(2,4;2,5)0,009

3,9(3,8;3,9)0,002

3,7(3,6;3,8)0,002

N-ацетилцистеин

0,25 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,7(2,6;2,8)0,899

4,4(4,2;4,4)0,336

4,2(4,1;4,2)0,342

0,5 мМ

0,3(0,3;0,3)0,750

2,7(2,6;2,8)0,899

4,4(4,3;4,4)0,079

4,2(4,2;4,2)0,025

1 мМ

0,3(0,3;0,3)0,750

2,7(2,6;2,8)0,900

4,3(4,3;4,4)0,167

4,2(4,2;4,3)0,015

2 мМ

0,4(0,3;0,4)0,313

2,9(2,9;3,0)0,104

4,3(4,2;4,3)0,738

4,3(4,2;4,3)0,008

4 мМ

0,4(0,3;0,4)0,313

2,9(2,9;3,0)0,120

4,0(4,0;4,0)0,002

3,9(3,9;4,1)0,092

Метилэтилпиридинол

0,25 мМ

0,3(0,3;0,3)0,750

2,7(2,6;2,8)0,899

4,2(4,2;4,2)0,099

4,1(4,1;4,1)0,455

0,5 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,6(2,6;2,6)0,386

4,2(4,2;4,2)0,027

4,0(3,9;4,0)0,010

1 мМ

0,3(0,3;0,3)0,750

2,6(2,5;2,6)0,182

4,1(4,1;4,1)0,002

4,0(3,9;4,0)0,010

2 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,4(2,3;2,5)0,003

3,9(3,9;3,9)0,002

3,8(3,7;3,8)0,002

4 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,2(2,2;2,2)0,002

3,7(3,7;3,7)0,002

3,3(3,2;3,3)0,002

Таблица 2

Влияние аскорбиновой кислоты на активность гентамицина (0,3 мг/л) в отношении культуры Escherichia coli ATCC25922

Концентрация антиоксиданта

Оптическая плотность бактериальной биомассы, Me(25 %;75 %)P,усл. ед. по Мак-Фарланду

4 часа

8 часов

12 часов

24 часа

1

2

3

4

5

0 (контроль)

0,1(0,0;0,1)

0,1(0,1;0,1)

0,2(0,2;0,2)

3,7(3,7;4,1)

Восстановленный глутатион

0,25 мМ

0,1(0,1;0,1)0,313

0,2(0,2;0,2)0,038

0,3(0,3;0,3)0,038

4,0(4,0;4,0)0,213

0,5 мМ

0,1(0,1;0,1)0,313

0,2(0,2;0,2)0,009

0,5(0,4;0,5)0,001

4,1(4,0;4,2)0,080

1 мМ

0,1(0,1;0,1)0,072

0,3(0,2;0,2)0,004

0,6(0,6;0,7)0,002

4,0(3,9;4,0)0,320

2 мМ

0,1(0,1;0,2)0,021

0,3(0,3;0,3)0,003

0,8(0,7;0,8)0,001

3,9(3,8;3,9)0,419

4 мМ

0,2(0,2;0,2)0,001

0,4(0,4;0,4)0,002

1,0(1,0;1,0)0,001

3,4(3,3;3,5)0,054

Аскорбиновая кислота

0,25 мМ

0,1(0,1;0,1)0,040

0,2(0,1;0,2)0,118

0,2(0,2;0,3)0,375

4,2(4,2;4,2)0,009

0,5 мМ

0,1(0,1;0,1)0,072

0,2(0,2;0,2)0,009

0,3(0,3;0,3)0,038

4,1(4,1;4,2)0,035

1 мМ

0,1(0,1;0,1)0,072

0,2(0,2;0,2)0,038

0,3(0,3;0,3)0,008

4,0(4,0;4,1)0,035

2 мМ

0,2(0,2;0,2)0,004

0,2(0,2;0,2)0,007

0,4(0,4;0,4)0,001

4,0(3,9;4,0)0,237

4 мМ

0,2(0,2;0,2)0,001

0,3(0,3;0,3)0,002

0,5(0,5;0,6)0,002

3,7(3,7;3,7)0,387

N-ацетилцистеин

0,25 мМ

0,1(0,1;0,1)0,072

0,1(0,1;0,2)0,294

0,2(0,2;0,2)0,813

4,2(4,1;4,2)0,017

0,5 мМ

0,1(0,1;0,2)0,021

0,2(0,2;0,2)0,038

0,3(0,3;0,3)0,008

4,1(4,1;4,2)0,039

1 мМ

0,2(0,2;0,2)0,004

0,2(0,2;0,2)0,009

0,3(0,3;0,3)0,008

4,2(4,2;4,2)0,013

2 мМ

0,1(0,1;0,2)0,021

0,2(0,2;0,2)0,009

0,4(0,4;0,4)0,002

3,9(3,9;4,0)0,351

4 мМ

0,2(0,2;0,2)0,001

0,3(0,3;0,3)0,003

0,6(0,5;0,6)0,001

3,7(3,7;3,7)0,561

Метилэтилпиридинол

0,25 мМ

0,1(0,0;0,1)0,313

0,2(0,1;0,2)0,118

0,3(0,2;0,3)0,138

4,1(4,1;4,1)0,085

0,5 мМ

0,1(0,1;0,1)0,040

0,2(0,2;0,2)0,009

0,3(0,3;0,3)0,006

4,1(4,0;4,1)0,115

1 мМ

0,2(0,2;0,2)0,001

0,2(0,2;0,3)0,005

0,5(0,4;0,5)0,001

4,0(4,0;4,1)0,150

2 мМ

0,2(0,2;0,2)0,001

0,4(0,4;0,5)0,002

1,0(1,0;1,1)0,001

3,7(3,6;3,7)0,561

4 мМ

0,3(0,3;0,3)0,002

1,1(1,1;1,3)0,002

3,1(3,1;3,3)0,001

3,5(3,5;3,5)0,072

Особый интерес представляет собой взаимодействие метилэтилпиридинола и гентамицина. Оба вещества обладают антибактериальными свойствами, но антиоксидант уменьшает активность антибиотика. Поэтому логичным является предположение, что метилэтилпиридинол и гентамицин являются конкурентными антагонистами, и, возможно, подавляют развитие бактерий за счет угнетения синтеза белка на уровне 30S-субъединицы рибосомы. Поскольку метилэтилпиридинол оказывает значительно более слабое действие, а его молярная концентрация превышает таковую для антибиотика, гентамицин не реализует антибактериальный эффект в полной мере.

Общим механизмом снижения чувствительности к гентамицину под влиянием антиоксидантов может быть изменение окислительно-восстановительного потенциала бактериальной трансляционной машины, обеспечивающей синтез белка и являющейся первичной мишенью действия гентамицина. В подтверждение имеются некоторые исследования, демонстрирующие изменение синтеза белка под действием веществ, влияющих на процессы свободнорадикального окисления [9]. Кроме того, антиоксиданты могут нейтрализовать токсические активные формы кислорода, образующиеся в результате неправильной упаковки белков и активации бактериальных ферментных систем Cpx и Arc [8].

Выводы

Установлено, что восстановленный глутатион в концентрациях 0,25–0,5 мМ стимулирует развитие бактерий, в концентрациях 2 и 4 мМ оказывает угнетающее действие. Аскорбиновая кислота, N-ацетилцистеин и метилэтилпиридинол оказывают слабое антибактериальное действие, причем сила эффекта напрямую зависит от концентрации антиоксиданта. Все изучаемые антиоксиданты вызывают снижение чувствительности изучаемого штамма к гентамицину. Особенно сильно активность гентамицина снижает метилэтилпиридинол. Полученные данные необходимо учитывать при использовании гентамицина при инфекции, вызванной Escherichia coli.

Рецензенты:

Смирнов И.В., д.м.н., зав. кафедрой фармакогнозии и ботаники, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул;

Карбышева Н.В., д.м.н., профессор кафедры инфекционных болезней, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул.

Работа поступила в редакцию 11.04.2013.