1. Эритропоэтин: особенности структурной организации, лиганд-рецепторных взаимодействий, внутриклеточные мессенджеры трансдукции сигнала. Эритропоэтин (ЭПО) – гликопротеин с молекулярной массой 30400 Д, имеет в составе молекулы до 40 % углеводов, в т.ч. 14 остатков сиаловой кислоты. В эмбриональном периоде ЭПО в основном продуцируется клетками печени, в дальнейшем – пери- и тубулярными клетками почек. Стимулом для синтеза ЭПО является снижение содержания кислорода в клетках, приводящее к формированию гипоксией индуцируемого фактора-1 (HIF-1) с последующей продукцией мРНК и собственно ЭПО [1]. Ген ЭПО содержит участок, комплементарный HIF-1a, связывание с которым запускает транскрипцию мРНК ЭПО. В течение 30 минут после начала гипоксии экспрессия HIF-1 уже определяется в клетках. Основной точкой приложения действия ЭПО являются бурст- и колониеобразующие единицы гранулоцитарно-моноцитарно-мегакариоцитарно-эритроцитарные, на которых имеются специфические рецепторы. ЭПО отвечает за пролиферацию, дифференцировку и угнетение апоптоза в этих клетках, при этом главным эффектом ЭПО является снижение скорости апоптоза эритроидных клеток-предшественниц в костном мозге. ЭПО оказывает действие через поверхностные рецепторы, количество которых не превышает 1000 на одну клетку. Рецепторы к ЭПО обнаружены также на клетках нервной ткани, яичников и яичек, матки, гладкомышечных клетках сосудов, кардиомиоцитах, эндотелиоцитах, эпителии легких и почечных канальцев [24]. Эти клетки способны не только экспрессировать рецепторы ЭПО, некоторые из них способны синтезировать сам ЭПО. Наличие таких потенций позволяет предположить, что ЭПО выполняет ряд функций, отличных от гемопоэтической [1, 31].
Внутриклеточная сигнализация, опосредующая пролиферацию и дифференцировку клеток после образования эритропоэтин-рецепторного комплекса, включает RAS-митогенактивирующую протеинкиназу, Akt/фосфатидилинозитол-3-киназу, JAК-2, транскрипционные факторы STAT-5, GATA-1, GATA-2, NF-2, NF-κB и др. На негемопоэтических клетках рецептор ЭПО ассоциирован с субъединицей βcR, входящей в состав рецептора КСФ-ГМ, ИЛ-3, ИЛ-5. Полагают, что рецептор ЭПО и субъединица βcR соэкспрессируются на поверхности нейронов, нефроцитов, гепатоцитов, кардиомиоцитов, эндотелиоцитов, формируя гетеродимерный комплекс [14].
Протекторный эффект ЭПО в неэритропоэтических тканях может быть опосредован связыванием с рецептором-1 фактора некроза опухолей и последующей активацией транскрипционных факторов JAК-2 и NF-κB [31]. При этом в клетках происходит фосфорилирование ряда протеинкиназ: STAT-5, Akt, ERK, Ras [27]. Комбинация ЭПО с инсулиноподобным фактором роста-1 усиливает защитный эффект ЭПО, в частности, в отношении нервной ткани через активацию фосфат идилинозитол-3-киназного/Akt/GSK-3β сигнального пути [19]. Антиапоптогенный эффект ЭПО реализуется за счет активации генов «семейства» bcl-2, bcl-XL и блокады соответствующих каспаз: 3, 7, 8, 9, а также регуляции активности проапоптогенных генов, например, bax и DP5 [22]. Показано, что нейропротекторный эффект ЭПО при экспериментальной модели ишемии-реперфузии головного мозга, а именно противоотечное действие, обусловлено не только вышеуказанными сигнальными путями апоптоза, но и вовлечением в процесс белка аквапорина-4 [15].
2. Плейотропные эффекты эритропоэтина: общая характеристика. Поиск эндогенных регуляторов гомеостаза мультитропного действия является актуальной и клинически востребованной задачей современной медицины [2, 3, 5–7]. В 1987 году Eschbach J.W. and al. впервые сообщили об успешном прохождении клинических испытаний рекомбинантного ЭПО для коррекции анемии у больных хронической почечной недостаточностью (ХПН). В 2000 году Eschbach J.W. опубликовал основные принципы лечения анемии с помощью ЭПО. Несомненно, клиническая важность коррекции анемии у больных с ХПН первостепенна тем не менее в последнее время появились сведения о других, плейотропных эффектах ЭПО [17, 21]. В частности, установлено позитивное влияние ЭПО на аффективный статус, психофизиологический статус, функциональное состояние вегетативной нервной системы у больных ХПН, реализуемое за счет антианемического и дезинтоксикационного действия [8, 10].
3. Гемостазиологические эффекты эритропоэтина. У больных ХПН после применения ЭПО в течение 12 недель наблюдается сокращение времени кровотечения, увеличение среднего объема и улучшение адгезии тромбоцитов. В условиях интактного организма ЭПО способен оказывать двоякий эффект на количество тромбоцитов в крови: малые дозы стимулируют их продукцию, при назначении больших – наблюдается двухфазный характер ответа: после фазы стимуляции наблюдается снижение числа тромбоцитов [13]. Vinhas J. and al. (1991) указывают, что ЭПО улучшает агрегацию тромбоцитов, а также укорачивает АПТВ. В перфузионных экспериментах in vitro было показано, что ЭПО улучшает взаимодействие тромбоцитов и субэндотелиальных структур. При измерении уровня растворимого Р-селектина в плазме оказалось, что прирост его был выше у пациентов, получающих ЭПО [29]. Установлено, что ЭПО-терапия усиливает спонтанную агрегацию тромбоцитов в цельной крови, а назначение больным ХПН аспирина полностью нивелирует данный эффект.
Нами в экспериментальных условиях in vivo, in vitro, а также у больных ХПН в условиях дефицита эндогенного ЭПО установлено, что применение ЭПО у больных с терминальной стадией ХПН снижает выраженность геморрагического синдрома в связи с повышением количества тромбоцитов в периферической крови, восстановлением тромбоцитарно-клеточных взаимодействий, функциональной активности тромбоцитов и эндотелиоцитов. Механизм гемостазиологических эффектов ЭПО реализуется за счет антианемического, ПОЛ-ограничивающего и дезинтоксикационного действия [4, 9, 11].
В культуре эндотелиоцитов ЭПО повышает содержание внутриклеточного кальция в покоящейся клетке, а также усиливает высвобождение кальция в ответ на норадреналин и ангиотензин-II [12]. В культуре эндотелиальных клеток и при экспериментальной патологии ЭПО оказывает пролиферативный и хемотаксический эффект, особенно выраженный в постишемическом периоде [23]. Внутривенное введение ЭПО в дозе 100–500 ЕД/кг здоровым людям вызывает активацию эндотелиоцитов: значимый прирост уровня Е-селектина более чем на 100 %, а также увеличение содержания Р-селектина и VCAM-1.
Применение ЭПО у больных с терминальной стадией ХПН в течение 16 недель наряду с коррекцией времени кровотечения приводит к повышению уровня фибриногена, фактора VIII, vWF и числа тромбоцитов. Данные изменения коагуляционного гемостаза могли бы быть отнесены на счет действия ЭПО как фактора, корригирующего анемию. Однако данное предположение опровергается тем, что укорочение времени кровотечения наблюдается уже через несколько дней после начала терапии ЭПО, когда уровень гемоглобина и гематокрит у ряда пациентов еще не изменяются. При этом в первые дни терапии ЭПО, когда основные показатели гемостаза (число тромбоцитов, ПТВ, АПТВ, уровень фибриногена) еще не изменяются, наблюдается снижение уровня антитромбина и плазминогена [32]. Некоторые исследователи приводят данные об отсутствии влияния ЭПО на внешний путь свертывания крови [16]. Оценка влияния ЭПО на активность противосвертывающей системы у больных ХПН показала, что уже через 1 месяц после начала терапии снижается уровень протеинов S и С, через 6 месяцев он нормализуется, но свободная фракция по-прежнему остается низкой, через 12 месяцев уровень протеинов S и С не отличается от исходного. Авторы сделали вывод, что нарушения антикоагулятной защиты, наблюдаемые в начале ЭПО-терапии, полностью нивелируются в течение 1 года [18]. Christensson A.G. and al. (2001) показали, что колебания уровня протеина S вообще являются единственным значимым изменением системы гемостаза у больных ХПН при ЭПО-терапии.
Данные о влиянии ЭПО на систему фибринолиза также противоречивы: Opatrny К.Jr. and al. (1995) показали, что терапия ЭПО в течение 10 недель не приводит к каким-либо изменениям активности и уровня t-PA и PAI, как базальных, так и определяемых после венозной гиперемии. Эти же авторы полагают, что применение ЭПО при ХПН не оказывает влияния на показатели тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза, а также антикоагулянтной системы. Другие исследователи считают, что ЭПО повышает фибринолитическую активность, укорачивает время эуглобулинового лизиса. Pawlak K. and al. приводят данные, что назначение ЭПО оказывает нормализующий эффект на систему фибринолиза, если какие-либо показатели были исходно изменены, то через 8–12 месяцев терапии они нормализуются [28].
Механизм действия ЭПО на систему гемостаза в целом следует считать малоизученным. Заслуживают внимания сообщения Malyszko J. and al. о роли серотонинергических процессов: улучшение ристоцетин-индуцированной агрегации тромбоцитов на фоне ЭПО положительно коррелирует с уровнем серотонина в плазме и тромбоцитах [25]. Borawski J. and al. (1998) пытались развить данную идею и смогли показать, что у больных ХПН, получающих ЭПО, имеется положительная корреляция между агрегацией тромбоцитов, уровнем серотонина в тромбоцитах и их количеством. Активно обсуждается вопрос о связи гемостазиологических и эпитропоэтических эффектов ЭПО. Wirtz J.J. and al. (1992) при повышении гематокрита у больных ХПН с 19 до 34 % наблюдали достоверное укорочение времени кровотечения, увеличение количества тромбоцитов, снижение порога реактивности тромбоцитов на АДФ, а из плазменных компонентов противосвертывающей системы – снижение активности протеинов С и S. Некоторые исследователи установили, что назначение ЭПО больным ХПН вызывает достоверное повышение вязкости цельной крови при неизменных показателях вязкости плазмы и деформабельности эритроцитов, а коррекция времени кровотечения под влиянием ЭПО, по их мнению, вообще не связана с улучшением функции тромбоцитов, а обусловлена только повышением гематокрита [30].
Учитывая высокую значимость процессов свободно-радикального окисления в патогенезе нарушений гемостаза, мы проанализировали данные об антиоксидантном эффекте ЭПО. Так, Eiselt and al. (2000) приводят данные о том, что у больных ХПН, не получающих ЭПО, уровень антиоксидантных систем в эритроцитах, а также СОД плазмы достоверно ниже, чем у здоровых доноров и больных ХПН, находящихся на ЭПО-терапии. Сведения о влиянии ЭПО на процессы свободно-радикального окисления при ХПН неоднозначны. Применение ЭПО у больных ХПН нормализует уровень глютатиона. Приводят и противоположные данные: у всех обследованных диализных больных независимо от ЭПО-терапии был повышен уровень ТБК-позитивных продуктов, а уровень антиоксидантных ферментов повышен по сравнению со здоровыми донорами, то есть имеются признаки как оксидативного стресса, так и компенсаторной активации антиоксидантных систем [26]. Считают, что ЭПО может оказывать антиоксидантный эффект за счет активации гемоксигеназы-1 и глутатионпероксидазы, а также снижения внутриклеточного содержания железа (II). Само по себе повышение уровня эритроцитов также может оказывать антиоксидантный эффект [20].
Таким образом, на современном этапе развития медицинской науки на феноменологическом уровне накоплен обширный материал о влиянии ЭПО на системы гемостаза и антигемостаза, количество и функциональную активность тромбоцитов, функциональное состояние эндотелиоцитов и плазменных протеолитических систем, участвующих в гемостазе. Представленные сведения неоднозначны и не формируют целостной картины о механизмах гемостазиологических эффектов ЭПО, что требует проведения дополнительных комплексных и широкомасштабных исследований для расширения показаний применения эритропоэтина в клинической практике с целью коррекции нарушений в системе гемостаза.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект 12-04-31726 «Механизм влияния эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов».
Рецензенты:
Абрамовских О.С., д.м.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии, клинической лабораторной диагностики, ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Минздрава России», г. Челябинск;
Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической химии, ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Челябинск.
Работа поступила в редакцию 18.03.2013.