Биологически активное вещество (БАВ) С16 синтезировано на кафедре высокомолекулярных и элементоорганических соединений Химического института им. A.M. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета и представляет собой с химической точки зрения н-гексадецилтрифенилфосфония бромид [2].
Микробиологические и фармакологические свойства БАВ С16 изучены в Казанской государственной медицинской академии на кафедре микробиологии и в Казанской государственной академии ветеринарной медицины на кафедре ветеринарной хирургии. Выявлены антибактериальный и фунгицидный фармакологические эффекты [4].
Эти свойства лекарства необходимы, в частности, при лечении мастита. Мастит – воспаление молочной железы, возникающее в ответ на воздействие факторов внешней и внутренней среды при снижении резистентности организма. Маститы представляют собой не только местный процесс, но и сопровождаются более или менее ярко выраженной реакцией всего организма. Воспалительный процесс в молочной железе, так же как и в любом другом органе, является сложной реакцией организма, возникающей в ответ на действие болезнетворных факторов – экзогенной и эндогенной инфекции [1].
Для введения в медицинскую практику нового БАВ необходимо разработать надежные методики контроля его качества. В современном фармацевтическом анализе органических лекарственных веществ широко применяются физические и физико-химические методы, такие как ЯМР-, УФ- и ИК-спектроскопия, элементный анализ, позволяющие проводить идентификацию лекарственных веществ, оценивать чистоту и количественное содержание по фармакологически активной части молекулы [5].
Цель: разработать оптимальную методику количественного определения н-гексадецил-трифенилфосфония бромида спектрофотометрическим методом.
Материалы и методы исследования
В качестве объекта исследования использовалась соль фосфония [(С6Н5)3Р + С16Н33]Вr- – н-гексадецилтрифенилфосфония бромид (С16).
По внешнему виду это кристаллический порошок белого цвета, без запаха, горького вкуса, ограниченно растворим в воде, хорошо растворим в эфире, хлороформе и спирте.
УФ-спектры поглощения БАВ С16 снимали на двухлучевом регистрирующем спектрофотометре Lambda 25 («Perkin Elmer», США) с использованием сервисного пакета программ «Perkin Elmer UV WinLab 5.2.0.0646/Lambda 25 1.27».
Количественное содержание н-гексадецилтрифенилфосфония бромида в субстанции определяли методом прямой УФ-спектрофотометрии на регистрирующем спектрофотометре Lambda 25 («Perkin Elmer», США). Статистическая обработка результатов количественного определения проводилась по методике, рекомендованной ГФ XI [3] .
Результаты исследования и их обсуждение
УФ-спектр поглощения 0,008 % раствора субстанции С16 в области от 240 до 283 нм имеет максимумы поглощения при 267 нм, что объясняется электронными переходами в ароматических кольцах (рис. 1).
Рис. 1. УФ-спектр поглощения раствора субстанции н-гексадецилтрифенилфосфония бромида
Изучение зависимости между оптической плотностью и концентрацией раствора С16 показало, что она имеет линейный характер, значение оптической плотности укладываются в интервал 0,2–0,8 мг/мл (табл. 1), значение коэффициента корреляции составляет 0,9998, что позволяет использовать данный градуировочный график для количественного определения С16 (рис. 2).
Для построения калибровочного графика готовили 7 растворов разведением стандартного раствора А (табл. 1).
Рассчитанный средний удельный показатель поглощения водных растворов БАВ С16 при длине волны 267 нм равен 60,62.
Методика. Около 0,08 г субстанции (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 200 мл, растворяют в 50 мл воды очищенной, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. 10 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора до метки водой очищенной и перемешивают (испытуемый раствор).
Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 267 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения используют воду очищенную.
Рис. 2. Определение подчиненности водного раствора субстанции н-гексадецилтрифенил-фосфония бромида основному закону светопоглощения
Таблица 1
Определение подчиненности раствора субстанции н-гексадецилтрифенилфосфония бромида основному закону светопоглощения и расчет удельного показателя поглощения
|
Концентрация, % |
Объем стандартного раствора, мл |
Общий объем разведения, мл |
Оптическая плотность (среднее) |
Е1 %, 1 см |
Е1 % ср., 1 см |
|
0,002 |
5 |
100 |
0,1323 |
66,17 |
60,62 |
|
0,004 |
10 |
100 |
0,2533 |
63,33 |
|
|
0,006 |
15 |
100 |
0,3651 |
60,83 |
|
|
0,008 |
10 |
50 |
0,4751 |
59,38 |
|
|
0,010 |
25 |
100 |
0,5897 |
58,97 |
|
|
0,012 |
15 |
50 |
0,6911 |
57,50 |
|
|
0,014 |
35 |
100 |
0,8147 |
58,19 |
Содержание [(С6Н5)3Р+ С16Н33]Вr– в субстанции в процентах (Х) вычисляют по формуле:
где Ах – оптическая плотность испытуемого раствора; Аст – оптическая плотность РСО; Сст – концентрация РСО; а – навеска субстанции, в граммах.
В качестве РСО использовали 0,008 % водный раствор [(С6Н5)3Р+ С16Н33]Вr– с известным содержанием основного вещества.
По разработанной методике проанализировали 5 образцов БАВ С16, результаты расчета количественного содержания показаны в табл. 2.
Расчеты количественного определения БАВ С16 проводили с помощью калибровочного графика, удельного показателя поглощения и сравнения оптических плотностей стандартного и анализируемого растворов.
Таблица 2
Результаты количественного определения субстанции н-гексадецилтрифенилфосфония бромида
|
По калибровочному графику |
По стандартному образцу |
По удельному показателю поглощения |
|
|
Образец |
Содержание, % |
Содержание, % |
Содержание, % |
|
1 |
99,07 |
99,11 |
99,01 |
|
2 |
99,75 |
99,71 |
100,01 |
|
3 |
99,01 |
99,05 |
99,03 |
|
4 |
99,03 |
99,02 |
99,03 |
|
5 |
99,03 |
99,21 |
99,95 |
|
|
99,18 |
99,22 |
99,41 |
, %
При оценке воспроизводимости результатов количественного содержания БАВ С16 методом УФ-спектрофотометрии на основе разработанной нами методики установлено, что выборка признана однородной и не отягощенной грубой ошибкой. Метрологические характеристики представлены в табл. 3, 4 и 5.
Таблица 3
Метрологические характеристики результатов спектрофотометрического количественного определения С16 при расчете по калибровочному графику
|
Наименование |
n |
F |
Р (%) |
t (Р, f) |
|
S2 |
S |
|
|
|
Показатели |
5 |
4 |
95 |
2,78 |
99,18 |
0,113 |
0,3215 |
0,41 |
0,42 |
, %
%
Таблица 4
Метрологические характеристики результатов спектрофотометрического количественного определения С16 при расчете по стандартному образцу
|
Наименование |
n |
F |
Р (%) |
t (Р, f) |
|
S2 |
S |
|
|
|
Показатели |
5 |
4 |
95 |
2,78 |
99,22 |
0,081 |
0,2834 |
0,35 |
0,36 |
, %
%
Таблица 5
Метрологические характеристики результатов спектрофотометрического количественного определения С16 при расчете по удельному показателю поглощения
|
Наименование |
n |
F |
Р (%) |
t (Р, f) |
|
S2 |
S |
|
|
|
Показатели |
5 |
4 |
95 |
2,78 |
99,4 |
0,275 |
0,5245 |
0,65 |
0,66 |
, %
%
Достоверность предложенной методики количественного определения подтверждена опытами с добавками. Результаты опытов представлены в табл. 6. Относительная ошибка опытов с добавками находится в пределах случайной ошибки предложенной методики, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки методики.
Таблица 6
Результаты количественного определения субстанции н-гексадецилтрифенилфосфония бромида с добавками
|
Введено, мкг/мл |
Найдено, мкг/мл |
Ошибка |
|
|
Абсолютная, мкг/мл |
Относительная,% |
||
|
80 |
79,66 |
+0,34 |
+0,43 |
|
80,24 |
–0,24 |
–0,30 |
|
|
79,50 |
+0,50 |
+0,63 |
|
|
Результат анализа Сх ± Δ, мкг/мл |
79,81 ± 0,36 |
||
Разработаны методики контроля качества нового БАВ с выраженной антибактериальной и фунгицидной активностью с применением качественных и количественных методов анализа. Подлинность подтверждается УФ-спектром. По полученным данным раствор субстанции н-гексадецилтрифенилфосфония бромида имеет максимум поглощения при длине волны 267 ± 1 нм. Установлена возможность применения метода УФ-спектрофотометрии для количественной оценки субстанции БАВ С16 и разработана оптимальная методика. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствует о том, что расчет содержания по стандартному образцу более точный (ошибка ±0,36 %).
Выводы
1. Изучены физико-химические свойства субстанции н-гексадецилтрифенилфосфония бромида с выраженной антибактериальной и фунгицидной активностью, на основе которых установлена его подлинность по УФ-спектру.
2. Разработана методика количественного определения субстанции н-гексадецил-трифенилфосфония бромида в пересчете на РСО методом спектрофотометрии. Наименьшая относительная ошибка результата определения при расчете содержания БАВ С16 по стандартному образцу с доверительной вероятностью 95 % (±0,36 %).
Рецензенты:
Шакирова Д.Х., д.ф.н., профессор кафедры, УЭФ ГБОУ ВПО «КазГМУ», г. Казань;
Фролова О.А., д.м.н., профессор кафедры общей гигиены, ГБОУ ДПО «КазГМА», г. Казань.
Работа поступила в редакцию 04.04.2013.