В начале XXI века сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) остаются важнейшей медицинской и социальной проблемой для всех экономически развитых стран. Один из основных факторов глобальной эпидемии ССЗ связан с широким распространением атеросклероза в популяции. Только в нашей стране от ССЗ заболеваний, которые возникают в результате атеросклероза, умирает более 1 млн человек ежегодно [1].
Из огромного количества теорий и гипотез патогенеза атеросклероза сегодня широкое распространение получили иммуновоспалительная и тромбогенная теории.
В настоящее время накоплено достаточное количество доказательств, полученных в экспериментальных и клинических исследованиях, свидетельствующих об участии системной воспалительной реакции в развитии атеросклероза [2, 3].
При этом воспалительная теория атерогенеза доказательно дополняется данными об участии иммунных и метаболических факторов прежде всего липидной природы в развитии атероматозного поражения сосудистой стенки [4].
В то же время существенным недостатком, затрудняющим эффективное проведение превентивных кардиологических мероприятий, является недостаточное количество знаний о механизмах инициации воспалительных реакций в самую раннюю стадию атерогенеза.
Цель исследования – изучение изменений биохимических, метаболических, иммунологических факторов, показателей инфракрасного спектра крови на самых ранних стадиях атерогенеза.
Материалы и методы исследования
Эксперимент выполнен на 20 беспородных кроликах-самцах, массой тела 3,75 ± 0,1 кг. Гиперлипидемию моделировали внутривенным введением 10 % жировой эмульсии для парентерального питания «Липофундин» производства Braun Medical (Германия) ежедневно по 0,5 мл/кг в течение 30 дней [5]. При работе с кроликами руководствовались требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных. Лабораторные исследования крови выполняли дважды: исходное значение показате-лей – перед первым введением и конечный уровень – через сутки после последнего введения препарата.
Липидный спектр сыворотки крови (общий холестерин – ОХС, триглицериды – ТГ, липопротеины высокой плотности – ЛПВП) исследовали, используя реактивы производства Biocon® (Германия). Рассчитывали концентрацию ЛПНП, ЛПОНП и коэффициент атерогенности (КА). Уровень лактата определяли энзиматическим методом с применением реактивов производства Biocon® (Германия). Количественное определение общей концентрации перекисей в плазме крови проводилось колориметрическим методом с использованием тест-системы «Oxystat» (Biomedica, Австрия). Биохимические исследования выполняли на автоматическом биохимическом анализаторе Flexor E (Vital Scientific, Нидерланды).
Концентрацию TNFα и СРБ в плазме крови исследовали методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью тест-систем производства Bender MedSystems® (Австрия) и ООО «Хема» (Россия). Результаты ИФА учитывали с помощью микропланшетного мультидетектора Zenyth 1100 (Anthos, Австрия). Уровень эндотоксинемии определяли хромогенным LAL-тестом по конечной точке, используя тест-систему фирмы Charles River Endosafe® (США).
Время свертывания определяли по методу Ли–Уайта.
Инфракрасный спектр изучался с использованием универсальной аппаратно-программной системы «ИКАР-9/1», разработанной в Тверской государственной медицинской академии под руководством профессора Каргаполова А.В., сертифицированной Госстандартом России как тип средств измерений (сертификат № 5745 от 20.11.98 г.).
При инфракрасной спектроскопии водных растворов и биологических жидкостей существенный вклад в полученные результаты вносит спектр воды. 30 мкл нативной плазмы помещали в кювету из KRS (пластинки из искусственного хлористобромистого таллия и иодистобромистого таллия) аппаратной части системы. Затем проводили спектрофотометрию. В качестве единицы измерения пропускания инфракрасного излучения в каждом диапазоне использовали коэффициент пропускания ×100 (у.е.)
Исследовали 9 диапазонов инфракрасного спектра: 3500–3100 см–1, 3085–2732 см–1, 2120–1880 см–1, 1710–1610 см–1, 1600–1535 см–1, 1543–1396 см–1, 1470–1330 см–1, 1170–1057 см–1, 1087–963 см–1[6].
Во всех выделенных группах рассчитывался средний уровень (М) и ошибка репрезентативности (m) анализируемых показателей. Достоверность изменения показателей в ходе эксперимента оценивалась по t-критерию Стьюдента для парных переменных.
Результаты исследования и их обсуждение
Проведенное исследование показало, что курс внутривенного введения кроликам 10 % жировой эмульсии вызывал развитие гиперлипидемии (табл. 1). При этом происходило разнонаправленное изменение концентраций липопротеинов, что можно охарактеризовать как дислипидемию, формирующую условия для атерогенеза, о чем свидетельствует высоко достоверное повышение коэффициента атерогенности.
Таблица 1
Биохимические, иммунологические показатели и время свертывания по Ли–Уайтупри экспериментальной гиперлипидемии у кроликов
|
Показатель |
Исходное значение |
Значение после курса |
|
ОХС, моль/л |
1,7 ± 0,82 |
2,6 ± 0,94* |
|
ТГ, моль/л |
0,75 ± 0,13 |
1,01 ± 0,4* |
|
ЛПВП, моль/л |
0,75 ± 0,24 |
0,53 ± 0,19* |
|
ЛПНП, моль/л |
0,95 ± 0,66 |
1,51 ± 0,74 |
|
ЛПОНП, моль/л |
0,35 ± 0,06 |
0,55 ± 0,25* |
|
КА, ед. |
1,74 ± 0,57 |
4,1 ± 1,86** |
|
Лактат, ед/л |
8,73 ± 1,46 |
15,66 ± 2,31** |
|
Общее количество перекисей, мкмоль/л |
347,3 ± 50,4 |
503,1 ± 68,6** |
|
Эндотоксин, ед/мл |
0,042 ± 0,016 |
0,049 ± 0,017 |
|
TNFα, пг/мл |
38,62 ± 7,02 |
40,51 ± 5,61 |
|
СРБ, мг/л |
0,04 ± 0,01 |
1,0 ± 0,44** |
|
Время свертывания, мин. |
6,67 ± 1,71 |
3,89 ± 0,56* |
Примечание: * – статистическая значимость различий относительно предыдущей группы (р < 0,05); ** – значимость различий относительно предыдущей группы (р < 0,01).
Изучение других биохимических и иммунологических показателей, проведенное параллельно с определением показателей липидного обмена, выявило достоверное нарастание уровней лактата, общего количества перекисей и СРБ. Концентрации эндотоксина (ЭТ) и TNFα при этом увеличились незначительно. Нарастание уровня СРБ при отсутствии реакции со стороны провоспалительного цитокина TNFα и индуктора иммунных реакций ЭТ можно объяснить повышением активности процессов перекисного окисления, в том числе и липидов, в частности, ЛПНП, которые, как известно, поглощаются макрофагами с образованием «пенистых клеток», участвующих в процессе атерогенеза. В свою очередь активированные макрофаги продуцируют провоспалительные цитокины, включающиеся в атеросклеротический процесс и формируют инициальное воспаление. Одновременно происходит достоверное уменьшение времени свертывания крови, что свидетельствует об активации системы гемостаза и ее вовлечении в процесс атерогенеза [7].
При исследовании инфракрасного спектра сыворотки крови было выявлено достоверное изменение показателей – увеличение пропускания инфракрасного излучения водным компонентом сыворотки в диапазоне, характеризующем деформационные колебания ОН-групп (2120–1880 см–1) и уменьшение пропускания в областях 3500–3100 см–1, характеризующих валентные колебания ОН-групп, 3085–2732 см–1 и 1600–1535 см–1 (табл. 2).
Таблица 2
Показатели инфракрасного спектра крови при экспериментальной гиперлипидемии у кроликов
|
Каналы |
Исходные значения, у.е. |
Значение после курса, у.е. |
|
1 3500–3100 см–1 |
1,689 ± 0,36 |
1,41 ± 0,12* |
|
2 3085–2732 см–1 |
4,91 ± 0,65 |
4,53 ± 0,66* |
|
3 2120–1880 см–1 |
23,50 ± 0,32 |
24,31 ± 0,47 ** |
|
4 1710–1610 см–1 |
17,72 ± 1,23 |
17,77 ± 0,59 |
|
5 1600–1535 см–1 |
2,74 ± 0,41 |
2,53 ± 0,2* |
|
6 1543–1396 см–1 |
8,59 ± 0,93 |
9,0 ± 0,51 |
|
7 1470–1330 см–1 |
8,46 ± 1,01 |
8,68 ± 0,64 |
|
8 1170–1057 см–1 |
10,36 ± 1,17 |
10,51 ± 0,58 |
|
9 1087–963 см–1 |
8,69 ± 1,03 |
8,51 ± 0,739 |
Примечание: * – статистическая значимость различий относительно предыдущей группы (р < 0,05); ** – значимость различий относительно предыдущей группы (р < 0,01).
Изменения инфракрасного спектра сыворотки крови указывают на изменения характера структурной организации водного компонента крови. Развитие атерогенной гиперлипидемии приводит к изменениям структурной организации водного компонента крови, что в последующем влечет значительную перестройку метаболизма и связанных с ней изменений структурно-функционального состояния различных органов и тканей, а также может являться предпосылкой развития внезапной сердечной смерти, морфологическим субстратом которой является атероматозное поражение коронарных сосудов [8].
Выводы
В проведенном исследовании показано, что у кроликов при экспериментальной гиперлипидемии развивается атерогенная дислипидемия, происходит нарастание уровней СРБ и эндогенных токсических субстанций – лактата и перекисей, способствующих атерогенезу, а также наблюдается уменьшение времени свертывания крови и изменение показателей инфракрасного спектра крови.
Таким образом, атерогенная дислипидемия за счет биохимических, метаболических и иммунных сдвигов, изменения структурной организации водного компонента крови на самых начальных этапах атерогенеза инициирует индукцию системного воспаления, усугубляющегося по мере прогрессирования хронического системного воспаления, вовлекая в процесс систему гемостаза, что закономерно ведет к поддержанию патологического процесса и его дальнейшему прогрессированию.
Рецензенты:
Баженов Д.В., д.м.н., профессор, проректор по работе с иностранными обучающимися и международным связям, профессор кафедры анатомии человека, ГБОУ ВПО «Тверская ГМА» Минздрава России,г. Тверь;
Коричкина Л.Н., д.м.н., доцент кафедры госпитальной терапии и профессиональных болезней, ГБОУ ВПО «Тверская ГМА» Минздрава России, г. Тверь.
Работа поступила в редакцию 04.04.2013.