Киндлинг, или раскачка, является одной из часто используемых экспериментальных моделей клинической эпилепсии, которая воспроизводит нарушения, наблюдаемые при этой нейропатологии. Височная эпилепсия (ВЭ) является тяжелой и наиболее распространенной формой фокальной эпилепсии, при которой повреждаются многие лимбические структуры. Механизмы возникновения и развития ВЭ пока неясны; возможно, что одной из причин этого является недостаточное внимание, уделяемое исследованию ритмической активности разных частотных диапазонов в различных областях мозга при эпилептогенезе.
В настоящее время принято считать, что генерация ритмической активности в мозге способствует быстрой и гибкой коммуникации различных структур, которую не могут обеспечить анатомические связи [16]. При этом различают как низкочастотные (дельта и тета), так и высокочастотные (гамма и рипплз) осцилляции. Дельта-ритм (0,5–4 Гц), имеющий таламо-кортикальное происхождение, обычно возникает во сне [11]; недавние работы указывают на то, что он участвует в когнитивной деятельности мозга, в частности, в принятии решений. Тета-осцилляции (4–10 Гц), имеющие септо-гиппокампальное происхождение [8], регистрируют преимущественно в гиппокампе и неокортексе и рассматривают как коррелят внимания и регистрации сигналов в системе памяти [8, 26]. Более высокочастотные гамма-осцилляции (40–80 Гц), имеющие внутригиппокампальное происхождение, участвуют в обработке информации и консолидации памяти [12, 27].
Ранее нами было продемонстрировано, что при электрическом киндлинге (повторяющейся стимуляции перфорирующего пути) повторная активация медиальной септальной области (МСО) введением в нее агониста ионотропных глутаматных рецепторов (L-глутамата) ускоряет эпилептогенез [2]. При этом наблюдалось постепенно нарастающее подавление тета-осцилляций в гиппокампе и МСО и нарушение септо-гиппокампальных взаимодействий. Целью данной работы было изучение изменений ЭЭГ, параллельно регистрируемой в пяти структурах мозга при фармакологическом киндлинге МСО, а также возможности формирования эпилептического очага в данной модели.
Материалы и методы исследования
Эксперименты на морских свинках, находящихся в состоянии спокойного бодрствования, проведены в соответствии с международными нормами этического обращения с животными (Experientia, 1995. 51. 1–5). За неделю до начала опытов всем животным вживляли электроды в различные структуры: в поле СА1 гиппокампа (Гипп), медиальное септальное ядро (МСО), центральное ядро миндалины (Мин), супрамамиллярное ядро (СМЯ) и энторинальную кору (ЭК). Референтный электрод ввинчивали в затылочную кость. Над МСО устанавливали канюлю, через которую во время экспериментов с помощью микрошприца осуществлялось введение 1 мкл препаратов.
Опыты поставлены на трех группах животных. Животным первой группы в МСО ежедневно (в течение 35–45 дней, в отдельных случаях до 92 дней) вводили физиологический раствор («контроль», n = 5) для изучения последствий механических влияний, вызываемых введением растворов. Во второй группе в МСО вводили L-глутамат (2,5 мкМ, «глутамат», n = 5), животным третьей группы одновременно вводили L-глутамат и антагонист ионотропных глутаматных рецепторов кинуреновую кислоту (1 мкМ, «глут + кин», n = 5), для проверки специфичности воздействий L-глутамата. Методические детали даны в наших предыдущих работах [1, 2].
У всех животных сначала регистрировали исходную ЭЭГ, затем производили введение препаратов. Компьютерную регистрацию ЭЭГ осуществляли с помощью специальной программы в течение 60 минут. При обработке активности определяли частотную (в Гц) и мощностную (отн.ед.) характеристики дельта (0,5–4 Гц), тета (4–8 Гц), и гамма (40–80 Гц) осцилляций, а также корреляционные межструктурные отношения в этих полосах частот. В процессе анализа вычисляли коэффициенты кросскорреляции (Ккр) для каждой пары структур во всех полосах частот; по величине Ккр судили о степени взаимодействий между структурами. Для статистического анализа применяли линейную модель одновариантного анализа (one-way ANOVA). Изменения параметров принимались за статистически значимые при p < 0,05.
В экспериментах исследовали как непосредственные (кратковременные) эффекты, оказываемые введением веществ, так и долговременные изменения фоновой активности, сохранявшиеся изо дня в день. Кратковременные влияния анализировали в течение 30 минут в первые 1–5 дней опытов, когда еще не проявлялись эффекты киндлинга; долговременные изменения изучали путем сравнительного анализа фоновой активности, регистрируемой ежедневно до введения растворов. В работе приведены численные значения только для достоверных изменений параметров активности при p < 0,05.
Параллельно с электрофизиологическими экспериментами, осуществляли гистологический контроль состояния мозговых тканей и мониторинг поведения животных.
Результаты исследований и их обсуждение
Регистрация исходной ЭЭГ (до каких-либо воздействий) показала наличие дельта-, тета-, и гамма-осцилляций во всех изучаемых структурах – энторинальной коре (ЭК), супрамамиллярном ядре (СМЯ), гиппокампе (Гипп), медиальной септальной области (МСО) и миндалине (Мин).
Контрольная группа животных (введение физиологического раствора)
Кратковременные изменения. Непосредственно после введения раствора в первые пять дней опытов не обнаружено изменений ритмической активности ни в дельта-, ни в тета-диапазонах. Изменения выявлены лишь в гамма-диапазоне: мощность гамма-ритма несколько снижалась в ЭК (на 10,7 ± 6,1 %) и более заметно в Гипп (на 26,8 ± 13,1 %); частота гамма-осцилляций при этом не изменялась. Изменений корреляционных межструктурных отношений не было выявлено ни в одной полосе частот.
Долговременные изменения. Долговременных сдвигов мощности осцилляторной активности ни в одном диапазоне частот не наблюдалось. Частота ритмической активности в большинстве исследованных структур также не изменялась; отмечалось лишь незначительное снижение частоты тета-ритма в Гипп (на 11,0 ± 5,0 %). Вычисление Ккр обнаружило снижение межструктурных взаимодействий в тета-диапазоне между Гипп и ЭК (на 33,5 ± 11,0 %); отношения между другими структурами не изменялись ни в одной полосе частот. Таким образом, существенных долговременных сдвигов ритмических осцилляций и межструктурных взаимодействий, т.е. киндлинга, введение в МСО физиологического раствора не вызывало. Каких-либо изменений в поведении животных за время экспериментов также не было обнаружено. Гистологический контроль не выявил изменений состояния тканей мозговых структур.
Группа животных с введением глутамата
Кратковременные изменения. После введения глутамата наблюдались существенные изменения ритмической активности. Мощность тета-ритма повышалась в СМЯ, МСО и Гипп (на 27,9 ± 7, 24,8 ± 6,0, 22,6 ± 8,0 %) при незначительном снижении его частоты в Гипп (на 6,7 ± 3,3 %). В Гипп повышалась также мощность дельта-ритма, на 19,7 ± 2,8 %; частота дельта-осцилляций при этом не изменялась. В других структурах нарушений в характеристиках дельта-осцилляций не наблюдалось. Гамма-осцилляции практически не изменялись, лишь в СМЯ несколько снижалась их мощность (на 15,7 ± 11,0 %) без изменения частоты. Обнаружено изменения межструктурных взаимодействий, а именно, повышалось значение Ккр для Гипп-Мин в дельта-полосе на 19,0 ± 7,8 %,.
Долговременные изменения в фоновой активности. Введение L-глутамата в течение 35 дней в отличие от введения физиологического раствора, вызывало отчетливые долго длящиеся изменения осцилляторной активности во всех диапазонах частот. Так, в гиппокампе мощность тета-ритма достоверно снизилась на 30,2 ± 16,2 %; при этом снижение мощности тета-ритма обнаруживалось уже через 20 дней введения. Частота тета-ритма снизилась во всех исследуемых структурах: ЭК, СМЯ, Мин, МСО, Гипп (на 6,6 ± 0,9, 9,5 ± 0,8, 7,3 ± 4,4, 6 ± 2,6, 8,2 ± 4,7 %). У одного животного с длительной раскачкой (92 дня) мощность тета-ритма драматически снизилась во всех структурах: ЭК, СМЯ, Мин и Гипп (на 35,6 ± 1,1, 52,2 ± 3,6, 55,6 ± 4,3 и 63,3 ± 3,5 %). Мощность гамма-ритма также заметно уменьшилась во всех исследуемых структурах: в ЭК, СМЯ, Мин, МСО и, особенно сильно, в Гипп (на 18 ± 6, 35,3 ± 7,3, 12,9 ± 8,1, 19,6 ± 1,9 и 46,1 ± 5,5 %) без существенного изменения его частоты. В то же время дельта-осцилляции изменялись слабо: существенных сдвигов мощности не произошло ни в одной из структур, в то время как частота слегка снизилась лишь в Гипп (на 7,6 ± 3,6 %). Наблюдались и изменения взаимодействий некоторых структур: значение Ккр в тета-диапазоне снизилось для Гипп-ЭК на 38 ± 5,2 %, а в гамма-полосе оно снизилось для МСО-Мин, на 25,2 ± 12,4 %. Таким образом, введение глутамата вызывало существенные кратковременные сдвиги ритмических осцилляций и межструктурных взаимодействий, что сохранялось на длительное время и приводило к изменениям фоновых мозговых ритмов.
Кроме этого, выявлялись и другие изменения: в спонтанной активности всех структур возникали бифазные высокоамплитудные события (интериктальные спайки). У некоторых животных через 2 месяца введения глутамата регистрировалась спонтанная судорожная активность. Наблюдались и изменения в поведении животных: они становились возбудимыми, демонстрировали автоматизмы (интенсивное и продолжительное умывание, жевание), застывание на длительное время, беспокойство; регистрировалась также дрожь всего тела (стадия 2 по классификации Racine [24]); иногда наблюдались спонтанные ритмичные изгибания тела с потерей равновесия (стадия 3). Гистологические исследования показали формирование в гиппокампе аберрантных связей, обусловленные спрутингом цинк-содержащих аксонов нейронов зубчатой фасции.
Группа животных с введением глутамата и кинуреновой кислоты
Кратковременные изменения. Непосредственно после введения веществ мощность тета-ритма незначительно, но достоверно снижалась в ЭК, СМЯ, Мин и МСО, соответственно на 15,4 ± 0,2, 17,0 ± 2,0, 8,7 ± 0,2 и 13,5 ± 2,1 % без заметных сдвигов его частоты. Дельта-осцилляции повышались по мощности в Мин и МСО на 13,9 ± 0,4, и 11,6 ± 0,7 %, при этом их частота изменялась (снижалась) лишь в Гипп, на 13,2 ± 1,4 %. Гамма-осцилляции, напротив, снижались по мощности, но только в МСО на 17,6 ± 0,5 % без изменения их частоты. Межструктурные отношения в этой группе животных кратковременно изменялись лишь в диапазоне гамма-частот, но они были достаточно сильно выражены: Ккр снижался для Гипп-ЭК и Гипп-Мин (на 56,4 ± 2,9 и 62,7 ± 0,8 %, p < 0,05).
Долговременные изменения в фоновой активности. Введение L-глутамата совместно с антагонистом ионотропных глутаматных рецепторов кинуреновой кислотой в течение 31‒35 дней приводило к определенным сдвигам осцилляторной активности по сравнению с исходной. Так, в ЭК, СМЯ и Мин незначительно, но достоверно снизилась частота тета-ритма соответственно на 9,3 ± 2,5, 9,5 ± 4,3 и 7,3 ± 3,1 %, без изменения его мощности. Интересно, что в гиппокампе не наблюдалось каких-либо значимых изменений тета-ритма по отношению к исходной активности. Не изменилась в гиппокампе и мощность дельта-осцилляций, хотя их частота заметно снизилась на 35,2 ± 13,8 %. В отличие от этого гамма-ритм в Гипп подавлялся, его мощность снизилась на 50,8 ± 6,2 %, хотя частота не изменилась. В МСО существенно снизилась мощность тета-ритма (на 31,7 ± 14,3 %), в то время как его частотные характеристики не изменились. В других структурах не обнаружено долговременных изменений дельта- и гамма-осцилляций. В этой группе животных не выявлено также изменений межструктурных взаимодействий ни в одном диапазоне частот.
Таким образом, в этой группе животных в большинстве структур наблюдались отчетливо выраженные кратковременные изменения осцилляторной активности во всех частотных диапазонах. Однако долговременные изменения были выражены значительно слабее, чем в группе с введением глутамата. Заметных изменений в поведении животных не выявлялось.
Данная работа впервые показала, что при ежедневном длительном (в течение 35 дней, а у некоторых животных до 92 дней) введении в МСО L-глутамата изменялась ритмическая активность в височных структурах мозга, – гиппокампе, энторинальной коре и миндалине; изменялись параметры осцилляций и в структуре промежуточного мозга, СМЯ, которая анатомически связана с МСО [25] и, как предполагается, является вторым пейсмекером тета-ритма в гиппокампе [22]
Наряду с изменениями электрической активности, показанными в данной работе, поведенческий и гистологический мониторинг продемонстрировал наличие явных признаков эпилептогенеза при киндлинге МСО, хотя он был выражен менее отчетливо, чем при электрическом киндлинге перфорирующего пути [2].
При фармакологическом киндлинге МСО на поздних сроках раскачки обнаружены изменения осцилляторной активности во всех исследуемых структурах. Необходимо подчеркнуть, что наибольшие изменения наблюдались в тета-диапазоне: частота тета-ритма значимо снижалась во всех структурах; в гиппокампе тета-осцилляции существенно ослабевали также и по мощности на 30,2 ± 16,2 %. Ранее нами было показано, что гиппокампальные тета-осцилляции постепенно ослабевают и при электрическом киндлинге перфорирующего пути [19, 23]; это ослабление становилось еще более выраженным, если электростимуляция сопровождалась введением в МСО глутамата [2]. Снижение выраженности тета-осцилляций ранее было обнаружено и на пилокарпиновой модели эпилепсии [9, 20]. Интересно, что в нашей работе у интактных животных введение глутамата вызывало кратковременное повышение тета-осцилляций как в самой МСО, так и в гиппокампе (что подтверждает наши более ранние результаты [2]); при этом в СМЯ тета-ритм также усиливался, что указывает на контроль активности этой структуры со стороны МСО. Таким образом, нами обнаружено, что при длительной стимуляции МСО введением глутамата изменения тета-осцилляций противоположны их исходным кратковременным изменениям, вызываемым этим агонистом. Следовательно, киндлинг приводил к необратимым изменениям в нейронной внутрисептальной сети и, как следствие, в сети связанных с МСО структур. Анализ литературы показывает, что при эпилептогенезе в септальной области (медиальной и латеральной) наблюдается массивная гибель клеток, преимущественно ГАМКергических, но также части холинергических [15, 17]; это может приводить к спрутингу аксонных коллатералей на освободившиеся синаптические локусы и перестройке как септальной сети, так и связей МСО с другими структурами [9]. В гиппокампе и энторинальной коре также обнаружена массовая гибель клеток при эпилептогенезе [5, 10, 14]. В итоге это может вызывать нарушение септо-гиппокампального ритмогенеза [8, 27] и приводить к снижению выраженности тета-осцилляций.
В данном исследовании выявлены также долговременные изменения гамма-ритма: во всех структурах снижалась его мощность, причем, в гиппокампе это снижение было очень существенным почти в два раза. Изменения гамма-ритма может быть следствием перестройки внутригиппокампальной сети вследствие гибели нейронов гиппокампа [5, 14]. В дельта-полосе активность незначительно снижалась лишь в гиппокампе, что может быть отражением изменений в таламо-кортикальной сети. Интересно, что ослабевали также и межструктурные взаимодействия, причем именно в тех диапазонах частот, которые подавлялись при киндлинге МСО: между Гипп и ЭК в тета-диапазоне и между МСО и Мин в гамма-полосе. Ослабление взаимодействий между Гипп и МСО было показано нами ранее на модели электрического киндлинга; оно усиливалось при введении глутамата в МСО [2, 23]. В данной работе с киндлингом МСО показано ослабление структурных коммуникаций также между другими областями мозга (Гипп-ЭК и МСО-Мин), что вносит вклад в понимание механизмов эпилептогенеза. Ослабление межструктурных взаимодействий может объяснять нарушения когнитивных функций, выявляемых при эпилепсии.
Очевидно, что в нарушение осцилляций и межструктурных взаимодействий, выявленных в нашей работе, кроме гибели нейронов, вносят вклад также и другие факторы, ведущие к сетевой реорганизации, такие, как активация глутаматных и ГАМК рецепторов, немедленных ранних генов, транскрипционных факторов, нейротрофических факторов и синтеза белков, а также изменения рецепторов, нейрогенез и синаптогенез (см. Morimoto et al., 2004).
Ранее предполагалось протекторное влияние тета-ритма в генерации судорожной активности и эпилептогенезе [9, 19, 21]; при этом отмечалось, что тета-осцилляции подавляются при развитии ВЭ [2, 3, 9, 13, 20, 21]. Данная работа свидетельствует, что гамма-осцилляции, которые часто сопровождают тета-ритм [27], также могут противодействовать эпилептогенезу: их выраженность существенно снижается при длительном киндлинге, сопровождающемся развитием эпилептического очага.
Как показали результаты, полученные на контрольных животных, изменения осцилляторной активности, вызванные глутаматом, не были обусловлены механическими воздействиями на МСО: введение физиологического раствора не приводило к выраженным кратковременным и долговременным изменениям активности в мозге.
Опыты с длительным введением антагониста ионотропных глутаматных рецепторов кинуреновой кислоты (совместно с глутаматом) отчасти показали специфичность воздействий глутамата при киндлинге МСО. Так, при длительной совместной инъекции антагониста с глутаматом в гиппокампе не наблюдалось каких-либо значимых изменений мощности тета-ритма по отношению к исходной активности, также, как и в контроле; в то же время изолированное введение глутамата вызывало резкое подавление его мощности (особенно на позних сроках) и частоты. В других структурах сохранилось снижение частоты тета-ритма (кроме МСО); в то же время в самой МСО наблюдалось снижение его мощности, чего не было в группе с введением глутамата. Относительно гамма-ритма, его падение по мощности сохранилось лишь в гиппокампе (но оно было и в контрольной группе), в то время как в других структурах ослабления гамма-ритма не наблюдалось (исчезало). В этой группе животных не было выявлено и изменений межструктурных взаимодействий ни в одном диапазоне частот, также, как и в контрольной группе. Таким образом, изменения осцилляторной активности в этой группе животных были значительно менее выражены, чем в «глутаматной» группе. Однако полного «возвращения» к активности, наблюдаемой в контроле, не происходило. Это может объясняться, во-первых, тем, что частичное влияние L-глутамата сохранялось в результате его действия посредством метаботропных рецепторов, которые сохраняли свою активность при введении кинуреновой кислоты. Более того, кинуреновая кислота могла оказывать и собственные влияния на осцилляторную активность, подавляя через ионотропные рецепторы фоновое действие не только экзогенно вводимого агониста, но и эндогенного глутамата, которое имело место в исходной активности. В частности, именно этим можно объяснить тот факт, что при длительном изолированном введении L-глутамата частота дельта-осцилляций в гиппокампе снижалась незначительно (на 7,6 ± 3,6 %), в то время как при совместном его введении с кинуреновой кислотой частота дельта-осцилляций снижалась значительно сильнее (на 35,2 ± 13,8 %).
Таким образом, проведенные электрофизиологические, поведенческие и гистологические исследования показали, что фармакологический киндлинг МСО может приводить к эпилептогенезу, при котором наблюдаются существенные изменения осцилляторной активности во многих структурах мозга. Результаты способствуют выяснению механизмов височной эпилепсии и разработке подходов для ее терапии.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 12-04-00776-а) и гранта президента РФ (ведущие научные школы, НШ 850.2012.4).
Рецензенты:
Куликов А.В., д.б.н., ученый секретарь, ФГБУН «Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук», зав. сектором экспериментальной трансплантологии, г. Пущино;
Журавлева З.Н., д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории Системной организации нейронов, ФГБУН «Институт биофизики клетки Российской академии наук», г. Пущино.
Работа поступила в редакцию 11.02.2013.