В последние годы отмечается значительный рост числа онкологических заболеваний во всем мире. Среди всех онкологических заболеваний опухоли желудочно-кишечного тракта являются одними из самых распространенных уже не первое десятилетие [2]. На сегодня уже достоверно известны сотни причин, повышающих риск развития злокачественной патологии. Установлено, что главная роль в реализации канцерогенного эффекта принадлежит нейроэндокринной и иммунной системе [3]. Известно, что опухоли развиваются на основе выраженных нарушений иммунной системы [10].
Иммунная система человека представляет собой очень сложную многокомпонентную структуру, включающую ряд органов и чрезвычайно большое число разнообразных иммунокомпетентных клеток [12]. Эта система является главным барьером на пути инфекций, а также играет важную роль в том, как организм будет реагировать на онкологическое заболевание. Одну из ведущих ролей в обеспечении противоракового иммунного ответа выполняет тимус, в котором происходит дифференцировка основных популяций Т-лимфоцитов при регулирующем влиянии эпителиальных и дендритных клеток. От морфофункционального состояния тимуса зависит поддержание гомеостаза в организме и обеспечение стабильности его антигенных структур [5]. Считается, что при развитии опухолей инволюция тимуса и связанное с ней нарушение пополнения периферических Т-лимфоцитов лежит в основе развития Т-клеточного иммунодефицита [4, 7].
Цель исследования – изучить морфофункциональные изменения в тимусе крыс через 30, 60, 90 и 120 суток после введения 1,2-диметилгидразина в различной дозировке.
Материал и методы исследования
Изучен тимус 150 нелинейных крыс-самцов массой 150–180 г. При заборе материала учитывалась частота развития новообразований, их морфологические особенности, локализация. Кормление, уход и выведение из эксперимента крыс осуществляли в соответствии с правилами содержания лабораторных животных. Крысы были разделены на 3 группы. Первая (20 крыс) – интактные животные. Вторая (60 крыс) – экспериментальные животные, которым вводили внутрибрюшинно 1,2-диметилгидразин в общей дозе 40 мг/кг. Третья (60 крыс) – экспериментальные животные с внутрибрюшинным введением 1,2-диметилгидразина в общей дозе 80 мг/кг.
Объектом исследования служил тимус, который забирали через 30, 60, 90 и 120 суток после последней инъекции, взвешивали, затем изготавливали криостатные срезы толщиной 10 мкм.
Методы исследования:
1. Иммуногистохимический метод с использованием моноклональных и поликлональных антител фирмы Santa Cruze: МКАТ к CD3 (маркер зрелых Т-лимфоцитов); МКАТ к СD1А (маркер кортикальных тимоцитов); МКАТ к РСNA (маркер пролиферирующих клеток); ПКАТ к белку S-100 (маркер клеток нейроэктодермального происхождения и дендритных клеток); МКАТ к тучным клеткам, положительным к триптазе.
2. Метод окраски полихромным толуидиновым синим по Унна – для качественной и количественной характеристики популяции тучных клеток тимуса.
3. Люминесцентно-гистохимический метод Кросса, Эвена, Роста – для идентификации гистаминсодержащих структур тимуса.
4. Люминесцентно-гистохимический метод Фалька-Хилларпа – для избирательного выявления катехоламин- и серотонинсодержащих структур тимуса.
5. Окраска гематоксилином-эозином с последующей морфометрией коркового и мозгового вещества долек.
6. Морфометрический метод с использованием программы Микро-Анализ для измерения размеров люминесцирующих гранулярных клеток, толщины коркового и площади мозгового вещества тимуса.
7. Статистическая обработка полученных цифровых данных проведена с помощью пакета программ Microsoft office (Word и Eхcel) на компьютере. Статистическую достоверность определяли критерием Стьюдента (t).
Результаты исследования и их обсуждение
У интактных животных с помощью люминесцентной микроскопии выявляются дольки полигональной формы с хорошо различимым мозговым и корковым веществом. В паренхиме тимуса обнаруживаются люминесцирующие гранулярные клетки премедуллярной, субкапсулярной зон и тучные клетки, которые различаются по форме, расположению, размеру, а также по числу, размеру и цвету гранул. Субкапсулярные клетки, диаметр которых в среднем составляет 5,9 ± 0,4 мкм, беспорядочно располагаются на периферии коркового вещества. Диаметр премедуллярных клеток составляет в среднем 13,4 ± 0,9 мкм. В их цитоплазме содержатся крупные гранулы с беловато-желтой люминесценцией.
Нами с помощью постановки иммуногистохимических реакций установлено, что клетки мозгового вещества и кортико-медуллярной зоны у интактных животных дают положительную реакцию на белок S-100, являющийся маркером дендритных клеток.
В тимусе интактных крыс на окрашенных гематоксилином-эозином срезах хорошо определяются дольки округлой, овальной или полигональной формы со светлым мозговым и темным корковым веществом. На срезах, окрашенных полихромным толуидиновым синим, в междольковых промежутках обнаруживается небольшое количество тучных клеток, среди которых преобладают слабо дегранулированные и дегранулированные формы.
Нами выявлено, что через 30 и 60 суток после введения экспериментальным животным 1,2-диметилгидразина в общей дозе 40 мг/кг, несмотря на выявленные при гистологическом исследовании признаки развивающейся опухоли толстой кишки, морфофункциональная картина тимуса исследованных животных сходна с таковой у интактных крыс.
При введении 1,2-диметилгидразина в общей дозе 80 мг/кг в эти же сроки исследования наблюдаются цитоморфологические изменения в тимусной дольке. Уменьшается масса тимуса, толщина коркового и площадь мозгового вещества. Граница коркового и мозгового вещества стерта, люминесцирующие гранулярные клетки располагаются хаотично по всей ткани. Использование моноклональных антител на белок S-100 дает достоверное увеличение количества дендритных клеток в 2 раза по сравнению с интактными крысами, в то время как число СD3+, CD1A+ и PCNA+ клеток незначительно отличается от интактной группы животных.
Через 90 суток после введения канцерогена у экспериментальных животных обеих групп отсутствуют дольки правильной округлой формы. В основном встречаются крупные полигональные дольки, которые либо принимают полулунную, либо веретенообразную форму. Увеличивается масса тимуса и площадь мозгового вещества. При этом большую часть паренхимы тимуса замещает жировая и соединительная ткань. При люминесцентной микроскопии увеличивается количество клеток. При окрашивании срезов полихромным толуидиновым синим выявляются дольки с большим количеством тучных клеток. При введении канцерогена в меньшей дозе эти клетки обнаруживаются не в соединительнотканных перегородках, а в прилежащей соединительной ткани. Отмечается увеличение количества S-100+ клеток. При введении канцерогена в общей дозе 40 мг/кг и 80 мг/кг выявляется повышение СD3+, CD1A+ и PCNA+ клеток.
На более позднем сроке – через 120 суток ‒ на фоне появления опухоли в проксимальном отделе толстой кишки у крыс обеих групп выявляются значительные изменения в тимусе. Происходит сокращение массы тимуса, уменьшается площадь мозгового и толщина коркового вещества. При введении канцерогена в общей дозе 40 мг/кг при люминесцентной микроскопии выявляются дольки с малым количеством клеток, а в некоторых дольках визуализируются лишь их остатки в виде сплошных оранжеватых пятен или гранул с расплывчатыми контурами. Премедуллярные клетки малочисленны, встречаются скопления субкапсулярных клеток до 8–10 в поле зрения. При введении канцерогена в общей дозе 80 мг/кг выявляются деформированные дольки со множеством скоплений крупных, глыбчатых, ярко-желтых и наполненных гранулами ЛГК. На окрашенных гематоксилином-эозином срезах выявляется увеличение количества жировой и соединительной ткани. Количество тучных клеток вне зависимости от дозы введения 1,2-диметилгидразина увеличивается в основном за счет недегранулированных и слабодегранулированных форм. При этом у крыс с введением канцерогена в меньшей дозе эти клетки обнаруживаются в паренхиме тимуса. Иммуногистохимическими методами у животных обеих групп установлено увеличение числа дендритных и клеток, положительных к триптазе и уменьшение количества СD3+-, CD1A+- и PCNA+ – клеток.
Таким образом, наши исследования показали, что введение крысам 1,2-диметилгидразина приводит к значительному уменьшению размеров коркового и мозгового вещества долек, их деформации, резкому сокращению массы тимуса, жировому перерождению органа, увеличению тучных клеток и к дисбалансу уровня биогенных аминов. По-нашему мнению, эти изменения свидетельствуют о развившейся острой инволюции тимуса [1, 11]. При этом процесс более выражен и начинается раньше при введении канцерогена в общей дозе 80 мг/кг.
В наших исследованиях установлено, что у животных с введением канцерогена в общей дозе 80 мг/кг по сравнению с крысами, которым вводили канцероген в меньшей дозе, опухоли имеют более агрессивный фенотип, что проявляется в гиперэкспрессии белка p53 и раннем появлении отдаленных метастазов. Кроме того, у животных этой группы выявлено формирование синхронных опухолей пищевода, имеющих морфологию плоскоклеточной карциномы на фоне массивного вирусного поражения [7].
Механизмы развития акцидентальной инволюции тимуса на фоне развития опухоли до сих пор остаются до конца не выясненными. Вероятно, это может быть связано с прямой индукцией апоптоза тимоцитов [15] и уменьшением процента тимоцитов в S-стадии клеточного цикла [14]. Одним из ведущих считается недостаточное поступление клеток-предшественников в тимус, которые сохраняются в костном мозге в достаточном количестве и функционально полноценны. Считается также, что это может быть следствием миграции их в опухоль [13]. Кроме того, известно, что акцидентальная инволюция тимуса возникает как адаптационный механизм на стресс любой этиологии [9]. Можно предположить, что потенциальными индукторами инволюции тимуса могут быть глюкокортикоидные гормоны и такие цитокины, как TNF-α, IL-1, IL-4, TGF-β, VEGF [8].
Безусловно, патогенез развития инволюции тимуса сложен и многоступенчат, однако, по нашему мнению, основная причина – дисфункция взаимодействия в системе «надпочечники‒гипофиз‒тимус» [6]. Посредниками взаимодействия эндокринной и иммунной систем в этом случае являются дендритные клетки, способные при их стимуляции секретировать те или иные иммунорегулирующие факторы, в том числе и биогенные амины. Увеличение уровня глюкокортикоидов в крови, а также рост содержания гистамина и серотонина в тимоцитах, что и наблюдается в нашем эксперименте, запускает необратимую реакцию запрограммированной гибели клетки (апоптоза).
Рецензенты:
Ямщиков Н.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой гистологии и эмбриологии, ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ, г. Самара;
Гунин А.Г., д.м.н., профессор кафедры акушерства и гинекологии, ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова», г. Чебоксары.
Работа поступила в редакцию 07.03.2013.