Бесплодие является актуальной проблемой современного общества. Прогрессирующее ухудшение репродуктивного здоровья и демографической ситуации в стране позволяют признать проблему фертильности одним из приоритетных клинических и социальных направлений. Медицинская значимость женского бесплодия определяется необходимостью решения ряда вопросов, связанных со своевременной и правильной диагностикой, повышением эффективности его лечения и профилактики [3, 4, 9].
Установлено, что частота бесплодия, превышающая 15 %, значительно влияет на демографические показатели, превосходя суммарное воздействие на численность населения невынашивания беременности и перинатальной патологии [3, 7, 8]. Частота бесплодных браков колеблется в широких пределах и не имеет тенденции к снижению во многих странах мира.
Эндометриоз в большинстве случаев сопровождает бесплодие. Наиболее спорными являются причины развития бесплодия при наружном генитальном эндометриозе, а также патогенетическая связь этих двух состояний. Несмотря на длительную историю изучения эндометриоза, многие стороны этиологии и патогенеза этой болезни остаются на уровне гипотез [5]. Однако до настоящего времени не выработано единой точки зрения на причины развития бесплодия при наружном генитальном эндометриозе [10].
Одной из очевидных причин бесплодия при эндометриозе является «механический фактор», обусловленный развитием спаечно-рубцового процесса в области малого таза, что приводит к нарушению нормальных анатомо-функциональных взаимоотношений между яичником и маточной трубой, вызывает нарушение транспортной функции и проходимости маточных труб [1, 2]. Известно, что ТGF-β является противовоспалительным цитокином и участвует в процессах воспаления, тканеобразования, репарации, усиливает рост фибробластов и синтез коллагена, обладает иммуносупрессивным и противовоспалительным действием. При развитии патологии TGF-β является основным медиатором формирования фиброза, с чем связывают возможную роль цитокина в патогенезе эндометриоза [6].
В связи с этим целью настоящего исследования явился анализ функционального полиморфизма гена TGFВ при эндометриоз-ассоциированном бесплодии.
Материал и методы исследования
В исследовании приняли участие 236 пациенток репродуктивного возраста от 25 до 40 лет (средний возраст 30,22 ± 0,28 года), которые были госпитализированы в гинекологическую клинику ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России и в гинекологическое отделение ФГБУ «НИИАГП» СО РАМН в 2010–2012 гг. для выполнения лечебно-диагностической и оперативной лапароскопии и гистероскопии. Показанием к оперативному вмешательству явилось бесплодие. Основную группу составили 145 пациенток с эндометриозом, страдающие бесплодием. Диагноз эндометриоза был поставлен в результате осмотра брюшины и органов малого таза на наличие эндометриоидных очагов в ходе эндоскопических методов исследования с последующим гистологическим подтверждением. Группа сравнения была сформирована из 91 пациентки с бесплодием, которым была выполнена диагностическая лапароскопия и исключен генитальный эндометриоз. Лапароскопию и гистероскопию выполняли по стандартной методике с использованием аппаратуры фирмы «KarlStorz» (Германия).
У всех женщин было получено добровольное информированное согласие на забор и использование крови для проведения исследований. Кровь для молекулярно-генетических методов исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром в день операции. Стабилизированные образцы крови хранили при –70 °С до момента исследования. Выделение ДНК из периферической крови проводили сорбентным методом согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия). Исследование полиморфных участков генов цитокинов проводили с использованием аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР). Был исследован полиморфный вариантC-509T гена TGFB, расположенный в промоторном участке гена и отвечающий за уровень экспрессии соответствующего цитокина. Амплификацию осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «АмплиСенс-200-1» («ИнтерЛабСервис», Россия), в пробирках типа «Эппендорф» путём ПЦР, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе при использовании амплификатора «Терцик МС2» («ДНК-технология», Россия). После проведения ПЦР 8 мкламплификата разделяли в 2 % агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этидиум бромида, при напряжении 150 B в течение нескольких мин для последующей визуализации в ультрафиолетовом свете, подтверждающей наличие продукта амплификации. В качестве маркера размера ДНК использовали плазмидуp UC19, расщепленную рестриктазой MspI («Сибэнзим», Россия).
Для проверки нормальности распределения показателей использовали критерий Колмогорова-Смирнова; равенство выборочных средних проверяли по t-критерию Стьюдента (в случае нормального распределения) и U-критерию Манна–Уитни (при отклонении распределения от нормального). Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с эндометриозом сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах женщин, используя критерий χ2 с поправкой Йетса на непрерывность. Об ассоциации разных генотипов и аллелей с заболеванием судили по величине отношения шансов (oddsratio (OR)) с расчетом для него 95 % доверительного интервала (CI).
Результаты исследования и их обсуждение
В патогенезе генитального эндометриоза важная роль принадлежит нарушениям иммунного гомеостаза, в том числе и генетически обусловленным, предрасполагающим к определенному ответу иммунной системы на формирование эндометриоидных гетеротопий, их инвазию и распространение. В последние годы большое внимание уделяется изучению роли полиморфизма генов цитокинов в механизмах формирования эндометриоидных очагов [1, 4, 9].
Нами были получены следующие результаты. Для полиморфизма С-509Т гена TGFВ у женщин с бесплодием было выявлено преобладание гомозиготного генотипа CС (62,6 %), в то время как редким генотипом оказался TT(6,6 %), аналогичную тенденцию имело распределение частот встречаемости генотипов в группе пациенток, страдающих эндометриоз-ассоциированным бесплодием (табл. 1).
В то же время у женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием генотип ТТ и аллель Т полиморфизма С-509Тгена TGFВ выявлялись значимо чаще (χ2 = 5,49; р < 0,05; и χ2 = 6,36; p < 0,05 соответственно), чем у пациенток контрольной группы (см. табл. 1).
Было установлено, что концентрация TGF-β в сыворотке крови значимо выше в группе пациенток со спаечным процессом (р < 0,001; р < 0,05). При этом наибольшее содержание интерлейкина в сыворотке крови имело место среди женщин-носителей генотипа ТТ (pCC/TT < 0,05; pTT/CT < 0,05).
На следующем этапе нашего исследования был проведен анализ взаимосвязи полиморфизма С-509Тгена TGFВ со спаечным процессом органов малого таза у женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием (табл. 2).
В результате исследования нами была установлена ассоциация генотипов полиморфизма С-509Т гена TGFВ со спаечным процессом органов малого таза различной степени тяжести. У 75 женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием имел место спаечный процесс органов малого таза различной степени. Зарегистрировано, что у 80 % носителей генотипа ТТ локуса С-509Т гена TGFВ, ответственного за высокую продукцию TGF-β, был выявлен спаечный процесс органов малого таза, в тоже время у 60,2 % носителей генотипа СС он отсутствовал. Однако среди женщин-носителей генотипа СС спаечный процесс был обнаружен у 39,8 % (табл. 2).
Таблица 1
Распределение генотипов и аллелей полиморфизма С-509Тгена TGFВ (абс., %) среди обследованных женщин
|
Генотипы и аллели полиморфизма С-509Тгена TGFВ |
Характеристика обследованных лиц |
χ2, p |
|
|
Женщины с бесплодием n = 91 |
Женщины с бесплодием и эндометриозом n = 145 |
||
|
СС |
57 (62,60) |
71 (49,00) |
5,49 p < 0,05 |
|
СТ |
28 (30,80) |
53 (36,60) |
|
|
TT |
6 (6,60) |
21 (14,50) |
|
|
С |
142 (78,00) |
194 (67,20) |
6,36 p < 0,05 |
|
T |
40 (22,00) |
95 (32,80) |
|
Примечание: n – количество человек в группе. Анализ качественных независимых данных проводили с помощью критерия хи-квадрат Пирсона. р – уровень статистической значимости различий между группами. Статистически значимые различия считали при р < 0,05.
Таблица 2
Распределение генотипов полиморфизма С-509Тгена TGFВ (абс., %) среди женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием и спаечным процессом органов малого таза
|
Генотипы полиморфизма С-509Тгена TGFВ |
Отсутствие спаечного процесса n = 70 |
Наличие спаечного процесса n = 75 |
||
|
абс. |
% |
абс. |
% |
|
|
СС |
53 |
60,20 |
35 |
39,80 |
|
СТ |
14 |
33,30 |
28 |
66,70 |
|
ТТ |
3 |
20,00 |
12 |
80,00 |
Примечание: n – количество человек в группе. Анализ качественных независимых данных проводили с помощью критерия хи-квадрат Пирсона. р – уровень статистической значимости различий между группами. Статистически значимые различия считали при р < 0,05. χ2 = 13,592; р < 0,05; χ2 = 8,359; pCC/TT < 0,05; χ2 = 8,233; pCC/СT < 0,05; χ2 = 2,674; pCT/TT > 0,05.
Таким образом, выявленные нами закономерности позволяют определить вероятность развития не только эндометриоз-ассоциированного бесплодия, но и спаечного процесса органов малого таза, что может быть включено в программу обследования женщин с бесплодием.
Рецензенты:
Сотникова Л.С., д.м.н., профессор кафедры акушерства и гинекологии ФПК и ППС ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Томск;
Воронкова О.В., д.м.н., профессор кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Томск.
Работа поступила в редакцию 07.03.2013.