Изучение эталонных препаратов современной пыльцы и спор для выявления критериев их видовой диагностики имеет большое значение как для решения вопросов систематики отдельных таксонов, так и при спорово-пыльцевом анализе кайнозойских отложений. Обычно рецентную пыльцу обрабатывают ацетолизной смесью (9 частей уксусного ангидрида и 1 часть серной кислоты) в течение 3 минут. Это позволяет достичь ее сходства с ископаемыми пыльцевыми зернами. Однако не всегда использование этой методики приводит к желаемым результатам. Кроме того, в последнее время весьма затруднительно стало приобретение уксусного ангидрида, необходимого для приготовления ацетолизной смеси. По этой причине очень важны экспериментальные исследования, направленные на поиск таких методик, при применении которых обработанная пыльца имела бы как можно меньше повреждений, и элементы ее строения были доступны для изучения. Целью настоящего исследования было установить альтернативный и наиболее эффективный способ химической обработки пыльцевых зерен, на примере рецентной пыльцы Pinus sylvestris и Quercus dentata.
Материал и методы исследований
Материалом для исследования послужила современная пыльца Pinus sylvestris и Quercus dentata. Обработка пыльцевых зерен производилась с использованием ацетолизной смеси, 50 % раствора серной кислоты и 10 и 15 % раствора щелочи. В ходе эксперимента менялась продолжительность воздействия растворов на пыльцу при нагревании смеси на водяной бане (табл. 1). Затем обработанная пыльца отмывалась до тех пор, пока среда не становилась нейтральной. Дальнейшее исследование пыльцы осуществлялось с использование светового (Axioskop 40, Carl Zeiss) и сканирующего электронного (EVO 40, Carl Zeiss) микроскопов. При просмотре препаратов в световом микроскопе в качестве среды использовался глицерин.
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе эксперимента было установлено, что для проведения морфологических исследований пыльцевых зерен P. sylvestris в световом микроскопе наиболее оптимальным оказалось воздействие щелочью, а именно: 10 % раствором NaOH в течение 60 мин и 15 % – в течение 30 мин. Обработка пыльцы таким способом позволяет проводить измерения и хорошо различать элементы строения зерен. Менее благоприятной оказалась химическая обработка пыльцевых зерен ацетолизной смесью и 50 % раствором серной кислоты, вне зависимости от продолжительности воздействия растворов. В результате во всех исследуемых препаратах содержался большой процент деформированной (смятой) пыльцы с неясно выявляемой скульптурой щита и ячей мешков.
Таблица 1
Способы химической обработки пыльцы исследуемых в эксперименте видов
|
Химический раствор |
Pinus sylvestris |
Quercus dentata |
||||||||||
|
Время воздействия (мин) |
||||||||||||
|
10 % раствор NaOH |
5 |
10 |
30 |
60 |
12 |
40 |
60 |
80 |
120 |
|||
|
15 % раствор NaOH |
20 |
30 |
40 |
40 |
60 |
80 |
||||||
|
50 % раствор серной кислоты |
5 |
10 |
30 |
5 |
10 |
30 |
||||||
|
Ацетолизная смесь |
3 |
5 |
7 |
10 |
12 |
15 |
3 |
5 |
7 |
10 |
12 |
15 |
В табл. 2 приведены измерения основных параметров пыльцевых зерен Pinus sylvestris в зависимости от химической обработки. Наибольшие значения размеров пыльцы были получены после их обработки 15 % раствором щелочи в течение 30 мин, а наименьшие – обработанные ацетолизной смесью и 50 % раствором серной кислоты. Причем размеры пыльцевых зерен после воздействия 15 % раствором щелочи близки к размерам пыльцы, не подвергшейся химической обработке.
Таблица 2
Изменения основных параметров пыльцы Pinus sylvestris
|
Химическая обработка (время воздействия) |
Высота тела, мкм |
Ширина тела, мкм |
Длина тела, мкм |
Длина пыльцевого зерна, мкм |
|
Средние значения (диапазон изменения размеров) |
||||
|
10 % раствор щелочи (60 мин) |
43,45 (41,25–46,75) |
45,9 (41,25–49,5) |
51,56 (46,75–55,0) |
78,24 (68,75–85,25) |
|
15 % раствор щелочи (30 мин) |
42,35 (38,5–46,75) |
48,13 (44,0–52,25) |
52,94 (46,76–60,5) |
78,5 (70,13–85,25) |
|
50 % раствор серной кислоты (10 мин) |
35,55 (33,0–41,25) |
43,04 (33,0–46,75) |
47,04 (41,25–53,63) |
74,54 (68,75–85,25) |
|
Ацетолизная смесь (5 мин) |
– |
42,63 (33,0–46,75) |
46,75 (41,25–52,25) |
78,15 (71,5–88,0) |
|
Без обработки |
– |
46,89 (44,0–50,88) |
49,78 (46,75–52,25) |
77,89 (72,88–85,25) |
Изучение пыльцы Q. dentata показало следующие результаты. После обработки зерен 10 % раствором щелочи в течение 120 мин они приобретают желто-зеленую окраску, имеют правильную эллипсоидальную форму, округлотрехлопастные очертания, хорошо различимые элементы строения поверхности, видна ее зернистость и столбиковая структура. После обработки 15 % раствором щелочи в течение 40 мин оболочка пыльцевых зерен становится более окрашенной, что дает возможность детально рассмотреть ее строение. Химическая обработка зерен 50 % раствором серной кислоты и воздействие ацетолизной смесью более 7 минут оказались менее подходящими. В препаратах содержалось большое количество смятых и разорванных пыльцевых зерен с неясно просматриваемыми элементами строения оболочки. Наибольшие размеры экваториального диаметра наблюдались у пыльцы после обработки 10 % раствором щелочи в течение 120 мин, а наименьшие – обработанной ацетолизной смесью в течение 5 минут (табл. 3). Наибольшая толщина экзины (1,67 мкм) наблюдался у зерен, обработанных ацетолизной смесью, а наименьшая (1,52 мкм) – после воздействия серной кислотой.
Л.А. Куприянова [2], изучая морфологию современной пыльцы однодольных, отмечала, что обработанные щелочью пыльцевые зерна оказались более крупными, чем после воздействия ацетолизной смесью. Хотя, по мнению М.Х. Моносзон [3], изучавшей морфологию пыльцы семейства Chenopodicaeae, размеры пыльцевых зерен, в зависимости от различных методик обработки, существенно не изменяются. Однако большинство исследователей, при изучении морфологических признаков пыльцы приходят к выводу, что размеры зерен, обработанных ацетолизной смесью, превосходят размеры пыльцы после воздействия щелочью [1, 4, 5, 6].
Таблица 3
Изменения основных параметров пыльцы Quercus dentata
|
Химическая обработка (время воздействия) |
Экваториальный диаметр, мкм |
Диаметр аппокольпиума, мкм |
Толщина внешней оболочки зерна, мкм |
|
Средние значения (диапазон изменения размеров) |
|||
|
10 % раствор щелочи (120 мин) |
36,8 (33,45–39,6) |
17,35 (11,4–21,75) |
1,5 (1,2–2,25) |
|
15 % раствор щелочи (40 мин) |
29,73 (26,85–32,4) |
10,83 (8,4–12,9) |
1,49 (1,2–1,95) |
|
50 % раствор серной кислоты (10 мин) |
29,21 (25,5–34,05) |
14,01 (12,0–19,36) |
1,52 (1,2–2,35) |
|
Ацетолизная смесь (5 мин) |
28,11 (25,5–29,7) |
8,01 (5,7–10,05) |
1,67 (1,35–2,1) |
|
Без обработки |
33,41 (32,25-34,5) |
– |
– |
В результате изучения исследуемых в эксперименте видов с использованием сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) было выявлено, что в целом тип скульптуры пыльцевых зерен P. sylvestris и Q. dentata не меняется в зависимости от применяемых способов химической обработки. Тем не менее, при воздействии 50 % раствором серной кислоты на пыльцевые зерна Quercus dentata становится хорошо различима скульптура бороздной мембраны.
Пыльцевое зерно Quercus dentata
Следует отметить, что некоторые исследователи присутствие определенного количества смятой пыльцы считают одним из показателей процесса гибридизации или полиплоидии, клейстогамии или апомиксиса, а также нарушением условий существования растений. Однако в результате нашего исследования выявлено, что пыльца, собранная из одного микростробила и обработанная разными способами, может быть как нормальной, так и деформированной.
Заключение
Проведенное экспериментальное исследование показало, что наиболее эффективным и альтернативным способом химической обработки пыльцы оказался щелочной: для P. sylvestris воздействие 10 % раствором NaOH в течение 60 минут или 15 % – в течение 30 минут; для Q. dentata воздействие 10 % раствором щелочи в течение 120 минут или 15 % – в течение 40 минут. После ее применения значительное количество пыльцевых зерен имеют правильную форму и хорошо просматриваемые элементы строения их поверхности. Наибольшие значения размеров исследуемой пыльцы были получены также после их обработки щелочью. По всей вероятности, влияние способов химической обработки на пыльцу разных видов растений будет неодинаково. Это связано с тем, что строение и химический состав оболочек пыльцы различны, и, следовательно, они будут по-разному реагировать на воздействие определенных химических растворов.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ и Президиума РАН (№ 12-05-31201 и 12-I-П28-01).
Рецензенты:
Маркевич В.С., д.г.-м.н., главный научный сотрудник лаборатории палеоботаники БПИ ДВО РАН, г. Владивосток;
Голов В.И., д.б.н., главный научный сотрудник лаборатории почвоведения и экологии почв БПИ ДВО РАН, г. Владивосток.
Работа поступила в редакцию 07.03.2013.