В настоящее время источники излучения ИК-диапазона используются повсеместно в медицинской практике, обогреве помещений и уличных пространств, покраске, пищевой промышленности и др.
Взаимодействие ИК-излучения с живыми организмами с давних пор привлекало внимание исследователей и практиков своими предполагаемыми, хотя и недостаточно изученными возможностями. ИК-излучение представляет диапазон электромагнитных волн (0,7…1000 мкм), который лежит между оптическим спектром видимого света и радиоизлучением.
Важнейшим вопросом является, какие механизмы лежат в основе биохимических реакций при фотохимическом воздействии (низкая интенсивность излучения) и термическом (более высокая интенсивность) и выражаются в конкретный биологический отклик на ИК облучение.
Попытки объяснения механизмов биологического воздействия ИК-излучения с привычных позиций, в первую очередь, с точки зрения выделения тепла ни к чему не привели. В большинстве современных работ, описывающих первичные механизмы воздействия излучения, приводятся данные о том, что облучение взаимодействует с молекулами фотоакцептора и приводит к ускорению переноса электронов в дыхательной цепи благодаря изменению в редокс свойствах ее компонентов при фотовозбуждении их электронных состояний. [13, 15]
В работах [12, 22] показывается, что излучение приводит к активизации окислительного метаболизма.
Это очень важное свойство т.к. в процессе окислительного метаболизма микроорганизмами детоксицируются ксенобиотики (синтетические лекарственные средства, пестициды, различные химикаты и яды природного происхождения), происходит разложение загрязняющих веществ при биоремедиации [10]. В качестве фотоакцептора предполагается, что это цитохром-с-оксидаза в эукариотических клетках [3] и цитохромный комплекс bd, терминального фермента дыхательной цепи в прокариотах [1].
Механизм прямого возбуждения О2 считается одним из первых предложенных [2]. Данный механизм является очень маловероятным из-за запрещенных квантовых интеркомбинационных переходов при возбуждении излучением с λ = 760 и 1270 нм. Фотодинамические реакции с участием компонентов дыхательной цепи (флавины, гемы и Fe-S центры) могут происходить только в присутствии кислорода, т.е. в аэробных условиях. В опытах с культурой Saccharomycodes ludwigii, выращенной в аэробных или анаэробных условиях и облученной He-Ne лазером, была зарегистрирована стимуляция синтеза белка в обоих экспериментах, но различие состояло в местонахождении максимума на дозовой кривой [14]. Это говорит о том, что по крайней мере в данном конкретном случае механизм, связанный с 1О2, не принимает участия в фотостимуляции синтеза белка в дрожжах.
Не существует никаких убедительных доказательств о том, что перечисленные механизмы действительно являются первичными при облучении клетки.
Основные фотоакцепторы энергии ИК-излучения и её аккумуляция
Из химии известно, что поглощение и переизлучение определенной длины волны зависит от входящих в состав молекул хромоформных и ауксохромных групп в видимом спектре. Подобное происходит и в ИК-диапазоне. Валентные и деформационные колебания молекул, сопровождающиеся изменением эклектического дипольного момента μ связи, поглощают ту или иную длину волны и соответствуют полосам поглощения в спектре. В большинстве случаев ИК-излучение поглощается высоко интенсивными колебаниями полярных связей C–O, C = O, C–N, N = O, S = O, O–H и др.
Во время возбуждения электронных состояний заметная часть энергии возбуждения неизбежно превращается в тепло, что вызывает локальное и преходящее увеличение температуры абсорбирующих излучение молекул [16] Локальное кратковременное повышение температуры поглощающих биомолекул может вызывать структурные (например, конформационные) изменения и приводить в действие биохимические процессы, такие, как активация или ингибирование ферментов.
Проблема заключается в том, что до сих пор нет общепринятого механизма воздействия ИК-излучения низкой интенсивности (без теплового воздействия) на живые объекты. В работе приводится механизм, который основывается на концепции Г. Линга [17] и является универсальным и достоверно экспериментально доказанным.
Микроорганизмы состоят на 90 % из воды. ИК-излучение сильно поглощается молекулами воды за счет валентных, деформационных и либрационных колебаний, поэтому первичным акцептором в микроорганизмах являются примембранные слои воды на поверхности клетки и внутриклеточная вода. Даже если излучение поглощается другими соединениями в клетке, любое полимерное соединение окружено адсорбированными слоями воды, любое мономерное соединение окружено гидратной оболочкой, поэтому как бы то ни было энергия излучения передастся молекулам воды. По физическим свойствам вода зоны исключения (адсорбированная вода) резко отличается от обычной объемной воды. Молекулы воды в зонах исключения (ЗИ) более упорядочены и ориентированы, зоны вытесняют из себя даже такие маленькие частицы, как ионы (например, Na+), имеют более высокую вязкость, отрицательный электрический потенциал, меньшую излучающую способность и большую устойчивость. Также, чем ближе расположен слой адсорбированной воды к гидрофильной поверхности, тем более интенсивно поглощается излучение, особенно на длине волны 3 мкм, что соответствует валентным колебаниям ОН-группы [23]. ЗИ зависят от природы поверхностей, которыми они образованы. Теоретическая основа этих процессов подробно изложена в [18].
Работы Поллака убедительно показали, что энергия излучения может аккумулироваться в виде энтропии потерь и разделения зарядов только при наличии гидрофильной поверхности и воды. В ходе облучения происходит интенсивный рост ЗИ воды на поверхности, причем зоны вырастают большей толщины, чем без инфракрасного излучения [8].
Рост ЗИ повышает относительную устойчивость таутомеров, конформеров (структуры белка) и изомеров, что, вероятно, приводит к более согласованному протеканию биохимических каскадов реакций с минимальным риском образования биохимического «мусора» в клетке. За счет ионообмена протоны вытесняют адсорбировавшиеся ионы с гидрофильных поверхностей (например К+, Na+, Са2+, Mg+2, Cl–).
Таким образом, ИК-излучение запускает каскад реакций, направленных на образование новых структур и увеличение толщины ЗИ. При структурных перестройках на гидрофильных поверхностях (белки, преимущественно вторичной структуры (α-спирали и β-листы), ДНК, РНК, мембраны) электроны идут на образование диполь-дипольных связей и создаются отрицательно заряженные участки. Эти участки легко могут проводить электрическое возбуждение и исключать из себя протоны, увеличивая концентрацию протонов и ионов Н3О+ за пределами ЗИ. Подавляющее большинство молекул АТP образуется протонными ATP-синтазами (F0F1–ATP-синтаза), являющимися самыми маленькими из известных наноразмерных электромоторов природного происхождения. АТР-синтазы в бактериальных клетках встроены в плазматическую мембрану, у автотрофных эукариот ‒ в мембраны тилакоидов, а у гетеротрофных эукариот ‒ во внутреннюю мембрану митохондрий [11]. Белковые комплексы F1 и F0 у бактерий, цианобактерий и хлоропластов высших растений имеют одинаковый состав белковых субъединиц, α3β3γδε и ab2cn соответственно. F0F1–ATФ-синтаза митохондрий содержит дополнительно еще несколько минорных белковых субъединиц [21].
Работа АТФ-синтазы в режиме синтеза АТР сопряжена с переносом через неё протонов, путь которых пролегает через F0 и направлен в сторону F1. Путь переноса протонов включает следующие функционально важные элементы макромолекулярной конструкции:
Во-первых, каждая из субъединиц с в своей центральной части содержит протонируемую карбоксильную группу, которая способна присоединять протон, поступающий из кислотной области
(R–COO– + H+ → R–COOH),
и отдавать его в щелочную область
(R–COOH → R–COO– + H+).
Во-вторых, два протонных канала, расположенных в мембранной части F0F1–ATФ-синтазы. Один из них находится ближе к стороне мембраны, обращенной в область с повышенной концентрацией ионов водорода («кислотный резервуар»). Этот канал обеспечивает поступление протонов к контактирующей с ним депротонированной карбоксильной группе с-субъединицы (R–COO– + H+ → R–COOH). Другой канал, обращенный в противоположную сторону мембраны, обеспечивает диссоциацию протонов в область с пониженной концентрацией ионов водорода («щелочной резервуар») [5].
Главную роль в работе протонных каналов F0F1–ATФ-синтазы играют аминокислотные остатки субъединиц а и с, содержащие протонируемые группы, которые способны удерживать протоны и передавать их друг другу.
Протонный мотор компонента F0 проявляет большое функциональное сходство с протонными моторами жгутиков. И там, и там присутствует кольцо из множества небольших богатых α-спиралями белков, вращающихся относительно соседних неподвижных белков за счёт энергии протонного градиента [5].
Согласно законам биоэнергетики живая клетка избегает прямого использования внешних ресурсов для совершения полезной работы. Она сначала превращает их в одну из трех конвертируемых форм энергии («энергетических валют»), а именно в ATP, Δμн+ или ΔμNa+ [6]. Очевидно, что в количественном соотношении молекул воды в клетке на 3 порядка больше, чем ионов Na+ или молекул АТР. Практически вся вода в клетке входит в состав ЗИ, следовательно можно утверждать, что преимущественная часть энергии излучения запасается именно в виде Δμн+.
В данном случае при воздействии ИК-излучения энергия запасается в виде избыточных протонов в объемной воде, которые в дальнейшем идут на синтез ATP. Гордон С. экспериментально показал увеличение синтеза АТФ под воздействием ИК-излучения [11]. Третий закон биоэнергетики гласит «Энергетические валюты» клетки могут превращаться одна в другую. Поэтому получения хотя бы одной из них за счет внешних ресурсов достаточно для поддержания жизнедеятельности. Этот механизм является общим для всех живых существ.
Подавляющее большинство энергоёмких биологических процессов, таких как реакция биосинтеза, перенос различных молекул через биологические мембраны, белковое (мышечное) сокращение и др., сопряжено с энергодонорной реакцией гидролиза ATP, в результате которой образуется АDP и неорганический фосфат.
Реакция гидролиза ATP (АТP + Н2О → АDP + Pi) сопровождается выделением энергии, которая может быть использована для совершения полезной работы [5].
Возникновение специфических эффектов под воздействием ИК-излучения
В клетке под действием излучения помимо усиленного роста ЗИ и аккумуляции энергии в виде Δμн+ образуются временные структуры [8], которые носят сигнальную функцию. Источником энергии для образования сигнальных структур выступает Δμн+. Первопричиной любых функциональных изменений в клетке будет появление в результате нативной агрегации сигнальных структур, непрерывно возникающих и распадающихся в процессе ее жизнедеятельности.
Захваченная энергия излучения также идет на нативную агрегацию белковых молекул. Согласно концепции В.В. Матвеева [20], нативная агрегация является обратимой высокоспецифичной агрегацией белков, находится под генетическим контролем (запрограммированная агрегация) и производит временные структуры. Специфичность взаимодействий полипептидных цепей друг с другом (на внутри- и межмолекулярном уровнях) обеспечивают вторичные структуры, к которым в первую очередь относятся α-спирали и β-листы.
Сигнальные структуры могут быть центрами связывания ионов, молекул и белков; обладать ферментативной активностью; образовывать каналы и межклеточные контакты; служить матрицей, организующей взаимодействие молекул в синтетических и транспортных процессах; могут служить рецепторами сигнальных молекул и являться основой для построения еще более сложных надмолекулярных структур. Смысл существования структурных «вспышек» в том, что при переходе в активное состояние клетке необходимы новые ресурсы, функции, механизмы, регуляторы и сигналы. Как только клетка переходит в состояние покоя, необходимость в этих структурах исчезает и они разбираются [20].
Несмотря на все разнообразие белков, все они имеют абсолютно одинаковый полипептидный остов, различия между белками обусловлены лишь боковыми цепями. Полипептидный остов всех белков представляет собой правильное чередование положительных (NH) и отрицательных (CO) зарядов пептидных связей, причем расстояние между этими группами оказывается соизмеримым с размером молекул воды и длиной водородных связей между ними. Иначе говоря, расположение указанных диполей вдоль полипептидного остова оказывается в структурном отношении комплементарным структуре воды. Другая особенность групп пептидной связи состоит в том, что они образуют водородные связи либо друг с другом (во вторичных структурах), либо с водой (развернутые участки полипептидной цепи) [5].
Как только развернутый полипептид, адсорбировавший воду, начинает сворачиваться с образованием вторичных структур, пептидные группы отказываются от водородных связей с водой и образуют их между собой. Прежде связанная вода десорбируется и приобретает свойства объемного растворителя [19].
α-спирали построены исключительно из одного типа стереоизомеров аминокислот (L). В белках преобладает правозакрученная структура. В 1973 году Чотиа заметил, что в белках β-листы всегда скручены как правый пропеллер, а плоские и левопропеллерные β-листы практически не встречаются [9]. Вода ЗИ выстраивается на поверхностях, повторяя структуру поверхности.
Как было отмечено ранее, ЗИ на поверхности также специфичны, как и поверхности их образовавшие. Данная специфичность позволяет узнавать и взаимодействовать между молекулами через собственные ЗИ, находясь в отдалении друг от друга.
Таким образом, различные микроорганизмы могут показывать различные биологические эффекты на один и тот же тип ИК-излучения.
Вода ЗИ в клетке и в модельных системах более упорядочена, чем объемная [17], поэтому встраивание молекулы растворенного вещества в растворитель с более жесткими связями энергетически невыгодно, и они вытесняются из системы. Выстроенные слои из адсорбированной воды служат путями транспортировки возбуждения от рецептора к рабочему биополимеру.
Такой взгляд на взаимодействие гидрофильных поверхностей полимеров с водой получил убедительное экспериментальное подтверждение [23].
Таким образом, повышается чувствительность рецепторов и активность в клетке в целом.
Заключение
В настоящей работе представлен физико-химический механизмах воздействия ИК-излучения на микроорганизмы. Показано, что одним из главных звеньев является ускорение образования ЗИ воды, которые вытесняют из себя протоны, создавая таким образом разность электрохимических потенциалов ионов водорода (Δμн+) за пределами ЗИ. Поток протонов взаимодействует с АТФ-синтазой, результатом чего является синтез АТФ из АДФ и фосфата. Сами ЗИ являются высокоупорядоченными многослойными участками с отрицательным потенциалом и высокой поглощающей способностью в ИК-диапазоне. ЗИ являются путями для протекания электронного возбуждения от рецептора до рабочей макромолекулы. Таким образом, ИК-излучение способствует повышению энергетического обмена и чувствительности к внешним и внутренним раздражителям, следовательно, облучение положительно сказывается на адаптации микроорганизмов к факторам окружающей среды.
Рецензенты:
Ростова Н.Б., д.фарм.н., профессор, ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава», г. Пермь;
Гейн В.Л., д.фарм.н., профессор, заведующий кафедрой физколлоидной химии, ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава», г. Пермь.
Работа поступила в редакцию 04.02.2013.