В последние десятилетия, как в России, так и за рубежом, ведутся активные исследования биологических эффектов низкотемпературной газоразрядной плазмы. Одной из привлекательных особенностей неравновесной плазмы является возможность использовать в биологических процессах энергию электронов, которая значительно выше, чем у ионов и нейтральных частиц, образующихся в газовой фазе. Электроны с высокой энергией вступают в столкновения с фоновым газом, в результате чего инициируются процессы диссоциации, возбуждения и ионизации. Поскольку ионы и нейтралы остаются относительно холодными, плазма не вызывает термических повреждений. Это открывает возможность использовать плазму для стерилизации термочувствительных материалов, включая биологические объекты, такие как клетки и ткани. Из всех возможных факторов, генерируемых плазмой, в биологических эффектах могут участвовать: тепло, заряженные частицы, реактивные нейтралы и электромагнитные излучения, но в основном это долгоживущие радикалы, напрямую взаимодействующие с биологическими субстратами. Согласно литературным данным стерилизация плазмой электрических разрядов высокоэффективна и сравнима с используемыми химическими методами (хлорирование, фторирование или озонирование) и с УФ-облучением. Однако применение сильных окислителей (хлор, озон) для разложения органических соединений приводит к появлению вторичных соединений (хлорорганика, озониды), являющихся токсичными для человека и животных. Озон является токсическим газом. Обработка УФ-излучением, как известно, высокоэффективна, но требует длительных временных режимов и многие условнопатогенные микроорганизмы способны выживать после кварцевания.
Газоразрядная плазма контактирует только с поверхностью объекта, а некогерентное излучение плазмы искрового разряда может проникать внутрь объекта и вызывать повреждения надклеточных и внутриклеточных структур. К настоящему моменту установлено, что низкотемпературная газоразрядная плазма обладает бактерицидным и цитотоксическим действием, но механизмы этих эффектов оценивались по пролиферативной активности микроорганизмов, количеству нежизнеспособных клеток или с помощью конфокального микроскопа[5, 6]. Детальный электронно-микроскопический анализ структурных изменений прокариотических и эукариотических клеток под действием излучения плазмы не проводился. В связи с этим целью исследования была оценка структурного состояния прокариотичеких и эукариотических клеток после воздействия излучением низкотемпературной газоразрядной плазмы в экспериментах in vitro.
Материалы и методы исследования
Эксперименты проведены на бактериальных штаммах антибиотико-резистентных грамположительных микроорганизмов Staphylococcus aureus 5913 и грамотрицательных микроорганизмов Escherichia coli 775-3, эритроцитах крови крыс, лимфоидных клетках, эпителиальных клетках протоков молочной железы. Бактериальные штаммы получены из музея кафедры микробиологии и иммунологии НижГМА. Штаммы лимфоидных клеток и эпителиальных клеток протоков молочной железы приобретены в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН г. Москва. Эритроциты получали путем центрифугирования гепаринизированной крови белых беспородных крыс при 3000 об./мин.
Для анализа готовились клеточные суспензии в растворе Хенкса с концентрацией 107 клеток в 1 мл.
Суспензии клеток обрабатывали излучением плазмы искрового разряда в различных временных режимах, выбранных на основании литературных данных.
Формирование импульсного искрового разряда, генерирующего излучение низкотемпературной плазмы, осуществляли с помощью экспериментального устройства ПИЛИМИН серии ИР-10. Устройство разработано в НИИ ядерной физики имени Д.В. Скобельцына МГУ имени М.В. Ломоносова в 2011 году. Характеристики используемого разряда: емкость импульсного конденсатора C = 3,3 нФ, балластное сопротивление R = 10 МОм, напряжение источника питания Uип = 11 кВ, частота повторения импульсов – 10 Гц.
Для электронно-микроскопического анализа суспензии необработанных и обработанных клеток центрифугировали, отбирали супернатант. Клетки фиксировали в 2,5 %-м растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН = 7,4) и в 1 %-м растворе четырехокиси осмия. Материал обезвоживали в спиртах восходящей концентрации с последующей заливкой в смесь аралдита и эпона 812 [3]. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на Ultracut UC7 фирмы «Leica». Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим и фуксином. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали на трансмиссионном электронном микроскопе Morgagni 268D фирмы FEI. С помощью видеокамеры Mega View изображение выводили на экран компьютера и работали в программе AnalySIS.
Результаты исследования и их обсуждение
Общими чертами импульсных высокоэнергетических разрядов является то, что они формируются за счет преобразования энергии электромагнитного поля (ЭМП) и электрического разряда в потоки частиц с энергией от 0,5 до 100 Дж. Энергия ускоренных частиц – это кинетическая энергия, которую приобретает заряженная частица, несущая один элементарный заряд (заряд электрона), при перемещении в электрическом поле между двумя точками с разностью потенциалов в 1 В (1 эВ = 1,60219∙10–19 Дж = 4,45∙10–12 кал).
В процессе формирования и развития электрического разряда в воздухе происходят процессы химических преобразований с различными атомами, молекулами, активными радикалами и ионами. Все физико-химические процессы, происходящие в плазме газового разряда, можно разделить на три временных интервала: 10-15 с - процессы возбуждения атомов и молекул электронным или фотонным ударом; 10-13 с - процессы ионизации и диссоциации атомов и молекул; до 10-3 с – стадия химических процессов и реакций.
При протекании реакции по стадиям производятся и расходуются так называемые промежуточные вещества - ионы, возбужденные молекулы, свободные радикалы. Радикалы - это молекулы в особом состоянии, когда происходит разрыв связи между атомами, молекулы приобретают свободные валентные связи. В результате свободные радикалы получают некоторую избыточную потенциальную энергию по сравнению с исходными молекулами. Как следствие, это приводит к увеличению химической активности.
Радикальные формы молекул и атомов служат передатчиками энергии от электронов плазмы к активным (ионизируемым или диссоциируемым) атомам или молекулам.
Известно, что под действием разряда в пробах воды снижается pH, накапливаются окислители и восстановители, ионы NH4+, идентифицированы радикалы HO2· и нитрозамины. Под действием искрового электрического разряда на воздухе доказано образование нитросоединений, содержащих группы CN, NH, и органических соединений, содержащих группы CH, CC [7]. Активные продукты, образующиеся в жидкой и газовой фазе разряда, вероятно, образуются и внутри клетки. Оксиды азота и радикальные продукты участвуют во многих метаболических процессах, в частности таких, как апоптоз и пролиферация клеток. В предыдущих работах показано, что воздействие излучением плазмы приводит к интенсификации окислительной модификации белков, деградации поверхностных углеводных структур клеток, изменению внутриклеточного рН, увеличению гидрофобности мембран клеток, изменениям в работе электрон-транспортной цепи [1]. В связи с этим логическим продолжением исследований в данном направлении является электронно-микроскопическая оценка структурных изменений клеток под действием излучения плазмы.
Клеточная оболочка бактерий состоит из клеточной стенки и находящейся под ней цитоплазматической мембраны. Клеточная стенка грампозитивных бактерий на 90 % состоит из пептидогликана, пронизанного тейхоевыми и липотейхоевыми кислотами, грамнегативных – 10–20 % пептидогликана, фосфолипиды, липополисахариды и белки [2]. Вероятно, действию факторов плазмы в первую очередь будет подвергаться клеточная стенка бактерий, повреждения которой могут приводить к нарушению жизненно важных функций клетки и, как следствие, приводить к её гибели. При электронно-микроскопическом анализе выявлено, что под действием излучения плазмы происходит набухание клеток, что, вероятнее всего, связано с нарушением водно-солевого баланса, наблюдается отслоение клеточной стенки, более выраженное для грамположительных бактерий, происходит деградация нуклеоида. Структурные изменения бактериальных клеток согласуются с литературными данными о метаболических изменениях в прокариотическах клетках под действием излучения плазмы [1].
Исследуя влияние физико-химических факторов на эритроциты, можно судить непосредственно о состоянии цитоплазматических мембран.
В контрольной серии преобладают эритроциты округлой формы, плотно наполненные содержимым. После воздействия излучением плазмы на эритроциты в течение 15 минут наблюдалось увеличение числа эритроцитов измененной формы, к 30 минутам обработки отмечается уменьшение количества внутриклеточного содержимого во всех эритроцитах. Данные электронно-микроскопического анализа согласуются с литературными данными, указывающими на порацию клеточных мембран под действием низкотемпературной газоразрядной плазмы [4].
Так как электронно-микроскопически была показана деградация нуклеоида прокариотических клеток, можно предположить, что ядро и ядерный аппарат эукариотических клеток также подвергается действию излучения плазмы искрового разряда. И поэтому для дальнейшего анализа были выбраны лимфоидные клетки и эпителиальные клетки протоков молочной железы.
В контрольной серии лимфоидные клетки преобладают округлой формы с крупным ядром. Под действием излучения плазмы в клетках наблюдается разреженность клеточного содержимого. С увеличением времени воздействия происходит нарушение целостности поверхностной и ядерной мембран, образуются поры.
В контрольной серии эпителиальные клетки протоков молочной железы имеют овально-округлую форму с крупным ядром, хроматин которого имеет мелкозернистую структуру. Ядрышки крупные. После воздействия излучением плазмы в течение 15 минут в клетках наблюдаются вакуолизация внутриклеточного содержимого и деформация ядерной мембраны, к 30 минутам обработки происходит разрыв ядерной мембраны.
В лимфоидных клетках и эпителиальных клетках протоков молочной железы после воздействия излучением плазмы наблюдаются как апоптотические, так и некротические процессы.
Выводы
1. Под действием излучения плазмы искрового разряда в прокариотических клетках наблюдаются отслоение клеточной стенки и деградация нуклеоида
2. Влияние излучения плазмы искрового разряда вызывает порацию цитоплазматической мембраны эритроцитов и выход клеточного содержимого
3. В эукариотических клетках под действием излучения плазмы искрового разряда наблюдаются деградация клеточного содержимого, порация цитоплазматической и ядерной мембран, апоптотические и некротические процессы
Рецензенты:
Заславская М.И., д.б.н., профессор кафедры микробиологии ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Н. Новгород;
Снопова Л.Б., д.б.н., зав. отделом морфологии центральной научной исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Н. Новгород.
Работа поступила в редакцию 17.12.2012.