В настоящее время в практике судебно-медицинской экспертизы отмечается рост числа определений наркотического анальгетика кодеина в органах человека. Это связано с увеличением доли смертельных случаев, вызванных употреблением относительно нового, легкодоступного наркотика дезоморфина (сленговое название «крокодил») [1]. В кустарных условиях дезоморфин получают взаимодействием кодеина, выделенного из лекарственных препаратов, со смесью кристаллического йода и красного фосфора [2].
Одним из наиболее распространенных методов определения лекарственных и наркотических веществ в различных объектах является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [3]. Вместе с тем определение этим методом отдельных компонентов, в частности, кодеина, в органах человека требует особо тщательной пробоподготовки, а в ряде случаев − применение токсичных растворителей. Кроме того, сложный состав проб предполагает применение особо чистых элюентов и периодическую регенерацию хроматографических колонок, что ведет к увеличению времени и стоимости анализа [4].
Весьма перспективным может быть использование метода люминесцентной спектроскопии (ЛС), который сочетает в себе высокую чувствительность, селективность, экспрессность с относительной простотой аппаратурного оформления [5].
Цель данной работы – изучение возможности люминесцентного определения кодеина в некоторых органах человека.
Материалы и методы исследования
Приборы и оборудование
Спектры и интенсивность люминесценции исследуемых образцов регистрировали на спектрофлуориметре «Флюорат-02 Панорама» (ООО «Люмэкс», Россия). Управление прибором и обработку результатов осуществляли на персональном компьютере с использованием программного обеспечения «Panorama Pro», версия 2.0.0.
Сравнительный анализ образцов проводили методом ВЭЖХ [4] на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО Институт хроматографии «ЭкоНова», г. Новосибирск, Россия) с УФ-спектрофотометрическим детектором и металлической колонкой (2×75 мм), заполненной сорбентом Prontosil 120-5 C18. Обработку хроматограмм проводили на персональном компьютере с использованием базы данных «БД-500» и программного обеспечения «МультиХром», версия 1.5x-E .
Пробоотбор и пробоподготовка
В качестве исследуемого биоматериала использовали образцы печени, стенки желудка, отобранные экспертами Отдела судебно-медицинской экспертизы трупов Красноярского краевого бюро судебно-медицинской экспертизы.
Навески биоматериала по 20 г, измельчали, тщательно перемешивали, а затем извлекали кодеин по методике [6]. Для этого к полученным пробам добавляли по 40 мл 0,01 М раствора HCI и настаивали 2 часа при постоянном перемешивании. Жидкие фазы отделяли центрифугированием (2500 об/мин) в течение 30 мин, а к твердым фазам добавляли по 20 мл 0,01 М HCI и повторяли операции, описанные выше.
Объединенные водные растворы трижды экстрагировали диэтиловым эфиром порциями по 20, 15, 15 мл в течение 15 минут. Эфирные экстракты отбрасывали, а водные растворы последовательно экстрагировали порциями по 15 мл в смеси хлороформ – бутанол (9:1) при рН = 8, хлороформа (рН = 10), диэтилового эфира (рН = 13). Экстракты «щелочных извлечений» кодеина объединяли, фильтровали через бумажный фильтр («красная лента») и упаривали досуха при комнатной температуре в чашках Петри. Полученные сухие остатки растворяли в 5 мл хлороформа. Эффективность извлечения кодеина в данном случае составляет около 85 %.
Для проведения люминесцентного анализа в пенициллиновые флаконы емкостью 15 мл отбирали по 2 мл полученных хлороформных растворов, упаривали досуха в токе воздуха при температуре 40 °С и сухие остатки растворяли в 5 мл 0,05 М H2SO4. Спектры люминесценции снимали в диапазоне длин волн 310–590 нм при длине волны возбуждения 300 нм [7].
Для сравнительного анализа методом ВЭЖХ также отбирали по 2 мл полученных хлороформных растворов, проводили операции, как описано выше, а сухие остатки растворяли в 1 мл метилового спирта. Аликвоты полученных спиртовых растворов по 0,1 мл помещали в специальные пробирки для ВЭЖХ и проводили измерения при следующих условиях: УФ-детектирование в диапазоне длин волн 220–300 нм (базовая длина волны – 210 нм); элюенты: А – [4,0 М LiClO4 в 0,1 M HClO4]:H2O в соотношении 5:95, В – ацетонитрил (в режиме градиентного элюирования); скорость потока элюентов – 200 мкл/мин; температура колонки – 40 °С; объем водимой пробы – 5 мкл.
Результаты исследования и их обсуждение
Спектр люминесценции раствора кодеина в 0,05 М H2SO4. представляют собой широкую бесструктурную полосу с характерным максимумом (λлюм) при 345 нм (рис. 1) [8].
Рис. 1. Спектр люминесценции раствора кодеина (1 мг/мл) в 0,05 М H2SO4
Предварительные эксперименты показали, что «щелочные извлечения» из образцов биоматериала, содержащего кодеин, также люминесцируют с λлюм = 345 нм. Это указывает на возможность его определения в присутствии сопутствующих компонентов.
Содержание кодеина в биоматериале можно определять по градуировочным графикам, полученным с использованием стандартных растворов, биоматериала, не содержащего кодеин, или методом добавок.
На рис. 2 в качестве примера приведен градуировочный график для люминесцентного определения кодеина, полученный с использованием стандартных растворов. Предел обнаружения кодеина, рассчитанный по 3S-критерию, составил 3 мкг/мл (n = 3, P = 0,95). Градуировочный график линеен до 1,0 мг кодеина на 1 мл раствора.
y = 6,040∙x; R2 = 0,998
Рис. 2. Градуировочный график для люминесцентного определения кодеина (λвозб = 300 нм, λлюм = 345 нм)
Содержание кодеина (Q, мг/г) в биоматериале можно рассчитать по уравнению:
Q = (C∙V1∙V3∙100)/(V2∙mн∙R), (1)
где C – концентрация кодеина, рассчитанная по градуировочному графику; V1 – общий объем раствора «щелочных извлечений» кодеина в хлороформе (5 мл); V2 – аликвотная часть раствора «щелочных извлечений» кодеина в хлороформе для его количественного определения (2 мл); V3 – объем раствора «щелочных извлечений» кодеина в H2SO4 (5 мл); mн – масса навески биоматериала (20 г); R – процент извлечения кодеина (85 %).
В табл. 1 приведены результаты люминесцентного определения кодеина в «модельных образцах» печени.
Таблица 1
Результаты люминесцентного определения кодеина в «модельных образцах» печени (n = 3, P = 0,95)
|
Содержание кодеина (Q ± δ), мг/г |
S |
Sr |
|
|
Введено |
Найдено |
||
|
0,050 |
0,047 ± 0,007 |
0,003 |
0,06 |
|
0,100 |
0,105 ± 0,009 |
0,004 |
0,04 |
|
0,250 |
0,245 ± 0,017 |
0,007 |
0,03 |
Как видно из табл. 1, полученные результаты методом «введено – найдено» удовлетворительно совпадают. Относительное стандартное отклонение не превышает 0,06.
Вместе с тем при проведении серийных анализов представляется более оправданным определять содержание кодеина в органах человека по градуировочному графику, полученному с использованием матрицы биоматериала. Для этого в навески биоматериала (20 г), не содержащего кодеин, добавляли стандартные растворы кодеина фосфата в этиловом спирте (1 мг/мл) и проводили пробоподготовку, как описано выше. В этом случае прямолинейная зависимость интенсивности люминесценции от содержания кодеина сохраняется в диапазоне 0,01–0,75 мг/г, а предел обнаружения составляет 3∙10–3 мг/г.
Исследование экспертных образцов. Для апробации разработанной методики люминесцентного определения кодеина в органах человека был взят случай реального отравления кодеинсодержащими препаратами. Исследованию были подвергнуты образцы печени и стенки желудка. В табл. 2 приведены сравнительные результаты определения кодеина методами ЛС и ВЭЖХ.
Таблица 2
Результаты определения кодеина в экспертных образцах методами ЛС и ВЭЖХ (P = 0,95; n = 3)
|
Экспертный образец |
Содержание кодеина (Q ± δ), мг/г |
|
|
Метод ЛС |
Метод ВЭЖХ |
|
|
Печень |
0,040 ± 0,005 |
0,035 ± 0,005 |
|
Стенка желудка |
0,133 ± 0,009 |
0,126 ± 0,012 |
Как видно из табл. 2, результаты люминесцентного определения кодеина в экспертных образцах удовлетворительно совпадают с данными независимого метода ВЭЖХ.
Полученные результаты люминесцентного определения кодеина в органах человека позволяют рекомендовать разработанную методику для ее использования в практике экспертных учреждений.
Выводы
1. Разработана люминесцентная методика определения кодеина (0,01–0,75 мг/г) в некоторых органах человека.
2. Методика успешно апробирована на «модельных» и экспертных образцах печени и стенки желудка с применением независимого метода ВЭЖХ.
3. Полученные результаты люминесцентного определения кодеина в органах человека позволяют рекомендовать разработанную методику для ее использования в практике экспертных учреждений.
Рецензенты:
Парилов С.Л., д.м.н., доцент кафедры судебной медицины ИПО, ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Красноярск;
Бурмакина Г.В., д.х.н., главный научный сотрудник Института химии и химической технологии СО РАН, г. Красноярск.
Работа поступила в редакцию 29.12.2012.