MOLECULAR IDENTIFICATION OF SPRING WHEAT GENOTYPES BY ALLELIC VARIANTS OF THE WAXY-GENES

Крахмал, являющийся основным компонентом зерновки пшеницы, представлен полисахаридами двух типов – разветвленного амилопектина и линейной амилозы, соотношение которых предопределяет технологические качества крахмала с тенденцией к улучшению мукомольно-хлебопекарных и технологических свойств зерна при снижении концентрации амилозы с 20 до 0 % [1, 2, 3, 4, 5, 6].

Амилоза крахмала синтезируется за счет активности гранул-связанной синтазы крахмала (GBSSI), кодируемой 3 генами, получивших название Waxy, чьи b-аллельные варианты локусов, являющиеся нефункциональными нуль-аллелями, влияют на образование крахмала с пониженным содержанием амилозы (при наличии одного или двух нуль-аллелей), и состоящего только из амилопектина (при наличии всех трех нуль-аллелей) [1, 2, 3, 4, 5].

Наиболее перспективными подходами к оценке аллельного полиморфизма Waxy-генов являются способы идентификации на основе молекулярно-генетических методов исследования – ключевого инструментария в маркер-вспомогательной селекции [1, 2, 3, 4, 5].

Целью настоящей работы являлась молекулярная идентификация перспективных генотипов яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ по аллельным вариантам Waxy-генов для создания сортов с высокими мукомольно-хлебопекарными и технологическими свойствами зерна.

Материалы и методы исследования

Молекулярно-генетическая оценка 70 образцов яровой пшеницы преимущественно селекции ТатНИИСХ на предмет идентификации генотипов по аллельным вариантам Waxy-генов проведена методами ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-анализа на основе общепринятых [4, 5] и разработанных нами способов генотипирования с дополнительным обоснованием достоверности полученных результатов исследования методом прямого секвенирования амплифицированных фрагментов ДНК.

Экстракция геномной ДНК из зерновок растений яровой пшеницы молочно-восковой спелости генерации 2012 г. осуществлена коммерческим набором «ДНК-сорб С» («ЦНИИ эпидемиологии», Россия). Амплификация геномной ДНК проведена на термоциклерах «Терцик» («ДНК-технология», Россия) и «MyCycler» с градиентом («Bio-Rad», США) с использованием олигонуклеотидных праймеров, перечень которых представлен в таблице.

Условия проведения ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-анализа для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы

Праймеры	Последовательности праймеров (5/-3/)	Локус	Режим амплификации	ПДРФ-анализ
4F	AAGAGCAACTACCAGT	Wx-A1 Wx-B1 Wx-D1	×1: 94 °С – 4 мин ×40: 94 °С – 30 с, 58 °С – 30 с, 72 °С – 30 с ×1: 72 °С – 7 мин
4R	TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA
4F-c	CCCCCAAGAGCAACTACCAGT	Wx-A1 Wx-B1 Wx-D1	×1: 94 °С – 4 мин ×40: 94 °С – 30 с, 64 °С – 30 с, 72 °С – 30 с ×1: 72 °С – 7 мин	AcsI 50 °C – 3 ч
4R	TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA
Wx-A1L:	CCCCAAAGCAAAGCAGGAAAC	Wx-A1	×1: 94 °С – 4 мин ×40: 94 °С – 45 с, 55 °С – 30 с, 72 °С – 1 мин ×1: 72 °С – 7 мин	HindIII 37 °C – 3 ч
Wx-A1R	CGGCGTCGGGTCCATAGATC

Детекция результатов ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-анализа выполнена методом горизонтального электрофореза в 2–3 % агарозном геле в буфере ТBE (рН 8,0), содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ = 310 нм) гельдокументирующей системы Gel Doc (Bio-Rad, США).

Размеры фрагментов ДНК оценены по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами. В работе использованы реактивы для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим» (Россия).

Секвенирование продуктов амплификации проведено на генетическом анализаторе «ABI PRISM 3500» в НПО «Синтол» (Россия). Выравнивание секвенируемых последовательностей ДНК осуществлено с использованием программы BLAST NCBI.

Результаты исследования и их обсуждение

По результатам молекулярной идентификации генотипов по аллельным вариантам Waxy-генов установлено, что из 70 происследованных образцов яровой пшеницы 65 растений (92,8 %) имели комбинацию активных аллелей Wx-A1a/B1a/D1a (1-ый дикий тип), 3 образца: Кк-11/06-11, Кк-11/06-10 и Кк-69/06-1 (4,4 %) – Wx-A1g/B1a/D1a (неклассифицированный тип), и лишь 2 линии: Кк-8/06-6 и О-192/03-5 (2,8 %) по классификации типов пшеницы с различным содержанием Wx-генов относились к 3-му типу (Wx-A1a/B1b/D1a) (табл. 2).

Для эффективной аллельной дискриминации Wx-A1g и Wx-B1e от нуль-аллелей Wx-A1b и Wx-B1b соответственно нами были разработаны оригинальные способы генотипирования, повышающие точность ДНК-анализа, с дополнительным обоснованием достоверности тестов секвенированием ПЦР-продуктов и депонированием расшифрованных нуклеотидных последовательностей в GenBank NCBI (GenBank A/N: JX649155-JX649158).

Оригинальность предложенного нами способа генотипирования в части аллельной дискриминации Wx-A1g от нуль-аллеля Wx-A1b заключается в реконструкции прямого праймера 4F [4, 5] путем наращивания его 5/-концевого участка пятизвенным oligo (dC)5 блоком для выравнивания температур плавлений реконструированного (4F-c) и обратного (4R) праймеров и подбора оптимальной температуры отжига (Ta = 64 °C). Сам же принцип дискриминации данных аллелей основан на учете как наличия амплификации фрагмента локуса Wx-A1g размером 257 bp разной степени интенсивности сигнала в постановке ПЦР с праймерами 4F + 4R [4, 5] (рис. 1, а, треки 5–7), так и отсутствия ПЦР-продукта размером 262 bp в предложенном нами способе генотипирования с олигонуклеотидами 4F-c + 4R (рис. 1, в, треки 5–7).

Помимо обоснования достоверности ДНК-тестов секвенированием ПЦР-продуктов дополнительно была проведена процедура ПЦР-ПДРФ-анализа по Wx-A1-локусу с праймерами Wx-A1L + Wx-A1R и эндонуклеазным расщеплением рестриктазой HindIII [5], также подтвердившая правильность интерпретации выявленных аллелей.

Оригинальность же разработанного нами способа генотипирования в части дискриминации нуль-аллеля Wx-B1b от активного Wx-B1e-аллеля заключается в подборе условий ПЦР-ПДРФ-анализа с праймерами 4F-c + 4R и эндонуклеазным расщеплением рестриктазой AcsI, генерирующих генотипические профили, в частности, с характерным для Wx-B1b-аллеля отсутствием ПДРФ-фрагмента длиной 84 bp (рис. 2, треки 6–7), или наличием неразрезанного ПЦР-продукта локуса Wx-B1e-аллеля размером 266 bp в виду отсутствия у него соответствующего сайта рестрикции (R↑AATTY).

pic_1.tif

Рис. 1. Электрофореграмма результата ПЦР-идентификации генотипов яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ по аллельным вариантам Waxy-генов. Обозначения: результаты ПЦР-идентификации с праймерами 4F + 4R (А) и 4F-c + 4R (B). М – ДНК-маркеры 100–1500 bp (СибЭнзим). 1–9 – генотипы с комбинацией Wx-аллелей: 1–4 – Wx-A1a/B1a/D1a; 5–7 – Wx-A1g/B1a/D1a. 8–9 – Wx-A1a/B1b/D1a

pic_2.tif

Рис. 2. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ-идентификации генотипов яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ по аллельным вариантам Waxy-генов. Обозначения: М – ДНК-маркеры 50–100 bp (СибЭнзим). 1 – ПЦР-профиль генотипа с комбинацией аллелей Wx-A1a/B1a/D1a (304/262/232 bp). 2–7 – AcsI-ПДРФ-профиль генотипов с комбинацией Wx-аллелей: 2 – Wx-A1a/B1a/D1a (156/148/114/84 bp); 3–5 – Wx-A1g/B1a/D1a (156/148/84 bp); 6–7 – Wx-A1a/B1b/D1a (156/148/114 bp)

Таким образом, из общего числа проанализированных образцов растений (табл. 2) наиболее перспективными генотипами, рассматриваемыми в качестве исходного материала для дальнейшей селекционной работы по созданию сортов яровой пшеницы с крахмалом амилопектинового типа (с низким содержанием амилозы), являются две линии Кк-8/06-6 и О-192/03-5, несущие в своем геноме нулевой Wx-B1b-аллель, с последующим введением Wx-A1b- и (или) Wx-D1b-аллеля путем скрещивания с донорами нуль-аллелей по локусам Waxy-генов.

Заключение

Представленная в настоящей работе информация является фактически первым опубликованным в виде научной статьи упоминанием о достоверном выявлении аллельных вариантов Wx-A1g и Wx-B1b Waxy-генов у генотипов яровой пшеницы отечественной селекции. Разработанные нами способы генотипирования по аллельным вариантам Waxy-генов повышают достоверность идентификации в части, касающейся дискриминации активных аллелей Wx-A1g и Wx-B1e от нуль-аллелей Wx-A1b и Wx-B1b.

Таблица 2

Молекулярно-генетическая оценка образцов яровой пшеницы на предмет идентификации генотипов по аллельным вариантам Waxy-генов

№ п/п

Сорт/линия

Waxy-гены

№ п/п

Сорт/линия

Waxy-гены

Казанская

Юбилейная

–

К-27/00-2

–

К-109/02-5

–

К-23/00-3

–

Экада 97

–

К-414/01-1

–

К-100/03-2

–

К-21/00

–

К-18/03-8

–

К-58/01-2

–

К-68/04-5

–

K-48/04-2

–

К-130/04-10

–

K-106/01-2

–

Злата

–

K-101/04-3

–

К-88/02-19

–

K-112/04-2

–

К-6/01-2

–

K-134/04-19

–

К-5/03-6

–

К-51/00-3

–

К-48/03

–

K-133/05-5

–

К-100/03-8

–

K-57/05-6

–

К-21/02-5

–

К-117/04-4

–

К-46/04-9

–

К-12/04

–

К-68/04-1

–

К-99/05-2

–

К-23/04-1

–

Кк-8/06-1

–

К-49/04

–

Кк-71/06-3

–

К-7/04-2

–

Кк-8/06-6

–

Экада 113

–

Кк-75/06-3

–

Экада 109

–

Кк-11/06-11

–

К-93/05-2

–

Кк-11/06-10

–

К-29/02-5

–

Кк-69/06-4

–

К-109/02-13

–

Кк-6/07-2

–

К-20/02-2

–

Кк-69/06-1

–

К-73/03-4

–

Кк-71/06-8

–

К-68/04-4

–

Кк-75/06-5

–

К-100/03-9

–

О-192/03-5

–

К-7/04-1

–

О-25/05-2

–

К-65/05-2

–

О-206/05-2, д.515-10

–

К-11/04-8

–

О-186/04-1

–

Экада 66

–

О-464/02-2

–

Казанская юбилейная (неполег.)

–

О-513/00-21

–

К-65/05-1

–

Эр.255/00-3-1

–

Симбирцит

–

О-28/05-2

–

Примечания:

+ – наличие соответствующих аллелей Waxy-генов;

– – отсутствие соответствующих аллелей Waxy-генов.

Рецензенты:

Абрамова З.И., д.б.н., профессор кафедры биохимии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета, г. Казань;

Багаева Т.В., д.б.н., профессор, зав. кафедрой биотехнологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета, г. Казань.

Работа поступила в редакцию 26.11.2012.

Scientific journal
Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

MOLECULAR IDENTIFICATION OF SPRING WHEAT GENOTYPES BY ALLELIC VARIANTS OF THE WAXY-GENES

Fundamental research
Scientific journal | ISSN 1812-7339 | Certificate - PI №77-15598