Поиск средств избирательного воздействия на отдельные этапы развития иммунного ответа, а также на отдельные субпопуляции клеток иммунной системы является одним из ведущих направлений экспериментальной и клинической иммунологии [4, 7]. Наиболее перспективный подход к решению данной проблемы - создание иммуностимуляторов на основе эндогенных биологически активных веществ пептидной природы [1].
Важную роль в качестве продуцентов иммуноактивных пептидов играют центральные органы иммунной системы. Достаточно хорошо изучены пептиды тимуса [5] и костного мозга [6]. Значительно меньше данных, касающихся пептидных регуляторов из сумки Фабрициуса - центрального органа гуморального иммунитета птиц, аналог которого у человека не идентифицирован. Известно, что экстракты бурсы Фабрициуса обладают иммунорегуляторными свойствами [8]. В последние годы за рубежом появляется много работ, связанных с выделением и синтезом различных активных пептидов из сумки Фабрициуса [9, 10, 11].
Цель исследования: изучение иммунологической активности пептида, выделенного нами из экстракта бурсы Фабрициуса.
Материал и методы исследования
Пептиды из ткани бурсы Фабрициуса цыплят выделяли оригинальной методикой, включающей уксуснокислую экстракцию с последующим фракционированием с помощью гель-фильтрации и обращенно-фазной ВЭЖХ [8]. На каждом этапе полученные фракции тестировали на наличие иммуностимулирующей активности. Дальнейшая работа велась только с наиболее активными фракциями. В результате последовательного разделения иммуноактивных фракций экстракта бурсы Фабрициуса нами был выделен пептид, обладающий по результатам скрининговых исследований, иммуностимулирующей активностью, и установлена на газофазном секвенаторе (Model 477A, Applied Biosystems). его первичная структура - Trp-Thr-Ala-Glu-Glu-Lys-Gln-Leu. Расширенное исследование иммунологической активности пептида проводили на его синтетическом аналоге. Пептиды синтезировали на твердой фазе с использованием Boc схемы, структуру синтезированных пептидов подтверждали масс-спектрометрическим анализом.
При анализе научно-технической и патентной литературы сведений о данном пептиде не обнаружено, что позволяет считать выделенное соединение новым иммуноактивным пептидом. В исследованиях, проведенных нами ранее было установлено, что данный пептид не обладает видовой специфичностью [8].
Исследования проведены на крови 18 больных раком шейки и тела матки после проведенной предоперационной лучевой терапии, операции и последующей химиотерапии.
Лимфоциты у этих больных выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин (r = 1,077 г/см3) и использовали в концентрации 2,5 млн клеток/мл. Пептид вносили в культуру лимфоцитов в концентрации 5 пмоль/мл и инкубировали в течение двух часов при 37 °C. В качестве контроля использовали физиологический раствор. Экспрессию дифференцировочных антигенов лимфоцитов и IgМ-рецепторов определяли методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции с моноклональными антителами («Сорбент», Москва; «Sigma», США) [3]. Флюоресценцию регистрировали с помощью люминесцентного микроскопа ЕС Люмам-РПО11. Просматривали не менее 200 лимфоцитов. Флюоресцентная микроскопия мембранных маркеров сопровождалась морфологическим контролем клеток в фазовом контрасте.
Влияние пептида на интенсивность иммунного ответа изучено на 92 цыплятах породы «Смена-2». Все исследования выполнены в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных», Хельсинкской декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (2000). На 19-е сутки инкубации у 72 эмбрионов произведена бурсэктомия. Остальные эмбрионы в эти же сроки были подвергнуты ложной бурсэктомии с воспроизведением всех этапов операции за исключением удаления бурсы. В первой серии экспериментов изучали влияние пептида на индуктивную фазу иммунного ответа. С этой целью бурсэктомированные птицы, начиная с месячного возраста, получали исследуемый препарат в дозе 5 нмоль/кг в течение трех дней. В экспериментах in vivo использована наиболее оптимальная дозировка (5 нмоль/кг), определенная нами в предварительных исследованиях активности пептида в более широком диапозоне доз от 0,5 до 50 нмоль/кг. Затем птиц иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ) внутрибрюшинно в дозе 7·109 клеток/кг и через 5 суток определяли состояние иммунитета. В следующей серии экспериментов исследовали действие пептида на продуктивную фазу иммунного ответа, для чего исследуемое вещество вводили цыплятам на 2, 3 и 4 сутки после иммунизации. На 5 сутки определяли титр антител к ксеногенным эритроцитам в реакциях гемагглютинации и гемолиза, число антителообразующих клеток (АОК) селезенки методом локального гемолиза в геле [7].
Полученные данные обработаны с помощью пакета статистических программ Statistica, версия 6,0, пакета программ Biostat и Microsoft Excel 2003. При сравнении показателей исследуемых групп использовались методы непараметрической статистики, в связи с ненормальным распределением значений в вариационных рядах. Числовые данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного интервала с указанием значения статистической значимости (p). При сравнении двух независимых выборочных совокупностей по одному признаку использовался критерий Манна-Уитни.
Результаты исследования и их обсуждение
Известно, что лимфоциты несут на своей мембране маркеры CD, способные выполнять функцию рецепторов, сигнальных или адгезивных молекул. Способность веществ усиливать или ослаблять экспрессию кластеров дифференцировки иммуноцитов и тем самым модулировать их функцию отражает иммунотропную активность препаратов. Нами исследовано влияние пептида на экспрессию поверхностных маркеров лимфоцитов онкологических больных, у которых наблюдается тяжелый комбинированный иммунодефицит.
У онкологических больных, и особенно после лучевой и химиотерапии, снижается количество лимфоцитов, несущих на своей поверхности все изучаемые кластеры дифференцировки, особенно антигены CD3 и CD4 (см. табл. 1).
Инкубация же лимфоцитов с пептидом сопровождается увеличением экспрессии дифференцировочных маркеров на мембране лимфоцитов. Изучаемый пептид обладает широким спектром действия, стимулируя экспрессию мембранных молекул Т-, В-лимфоцитов и NK клеток: CD2, CD3, CD4, CD16, CD25, CD21, CD22 и CD23 (см. табл. 1).
Установлено, что у онкологических больных более чем в 1,5 раза снижено количество лимфоцитов, несущих на своей мембране IgM. Под действием пептида экспрессия поверхностного IgM значительно возрастает (см. табл. 1).
Таким образом, синтезированный пептид оказывеют стимулирующее влияние на экспрессию ряда кластеров дифференцировки лимфоцитов.
Эмбриональная бурсэктомия представляет собой идеальную модель иммунодефицита с преимущественным поражением гуморального звена иммунитета, сопровождающегося нарушением антигеннезависимой дифференцировки В-лимфоцитов, снижением их числа, а также угнетением гуморального иммунного ответа как на Т-, так и на В-зависимый антиген. Поэтому мы решили оценить действие пептида на состояние иммунитета у цыплят с удаленной в период эмбриогенеза бурсой Фабрициуса. У эмбрионально бурсэктомированных птиц снижается иммунный ответ на введение ксеногенных эритроцитов (табл. 2).
Введение изучаемого пептида бурсэктомированным птицам в индуктивную фазу иммунного ответа приводит к увеличению титра гемагглютининов и гемолизинов в 2,7 и 2,5 раз соответственно, числа антителообразующих клеток в селезенке в 1,8 раза. В продуктивную фазу иммунного ответа пептид был неэффективен (см. табл. 2).
Таблица 1
Влияние пептида на экспрессию дифференцировочных антигенов лимфоцитов у онкологических больных, %, Ме (25-75 процентиль)
|
Изучаемые кластеры дифференцировки |
Лимфоциты здоровых доноров (контроль 1) (n = 20) |
Лимфоциты больных |
|
|
физ. раствор (контроль 2) (n = 18) |
пептид (опыт) (n = 18) |
||
|
CD2 |
81,6 (75,2-85,4) |
59,5 (53,8-64,2) p1 < 0,001 |
80,4 (77,1-84,9) p2 < 0,001 |
|
CD3 |
70,9 (65,9-74,3) |
45,7 (39,8-49,6) p1 < 0,001 |
68,3 (63,7-71,4) p2 < 0,001 |
|
CD4 |
39,6 (36,2-43,4) |
12,4 (9,8-16,2) p1 < 0,01 |
31,3 (26,3-35,7) p2 < 0,001 |
|
CD8 |
25,1 (22,3-29,7) |
18,6 (15,8-20,4) p1 < 0,01 |
19,5 (17,7-21,3) p2 > 0,4 |
|
CD16 |
13,8 (11,9-15,6) |
9,2 (7,4-11,1) p1 < 0,05 |
13,3 (11,8-14,6) p2 < 0,05 |
|
CD25 |
7,9 (6,7-8,9) |
3,2 (2,8-3,5) p1 < 0,01 |
8,2 ± (6,9-9,0) p2 < 0,001 |
|
CD19 |
9,5 (7,8-10,7) |
5,8 (4,9-6,5) p1 < 0,01 |
6,1 (4,8-6,7) p2 > 0,05 |
|
CD21 |
8,9 (8,1-9,5) |
4,6 (4,1-5,2) p1 < 0,001 |
8,4 (7,6-9,2) p2 < 0,001 |
|
CD22 |
9,9 (9,1-10,8) |
5,2 (4,7-5,9) p1 < 0,01 |
7,4 (6,9-7,8) p2 < 0,05 |
|
CD23 |
5,8 (5,3-6,2) |
3,1 (2,8-3,5) p1 < 0,01 |
6,2 (5,6-6,8) p2 < 0,001 |
|
CD72 |
7,3 (6,5-8,0) |
5,1 (4,6-5,8) p1 < 0,05 |
5,9 (5,1-6,6) p2 > 0,05 |
|
sIgM+ лимфоциты |
10,2 (9,8-10,7) |
6,1 (5,7-6,5) p1 < 0,05 |
8,7 (8,0-9,3) p2 < 0,05 |
Примечание (статистическая значимость различий): p1 - между контролем 1 и 2, p2 - между контролем 2 и опытом.
Можно предполагать, что полученный пептид, будучи биологически активным соединением, должен осуществлять свои функции через рецепторы на клетках-мишенях. Поэтому мы решили проанализировать возможность связывания его с поверхностью лимфоидных клеток. Для этого ФИТЦ-меченный пептид инкубировали с суспензией клеток селезенки мыши 30 мин при 4 °C. После инкубации клетки отмывали дважды и изучали с помощью иммунофлюоресцентного анализа. Всего в суспензии селезеночных клеток выявлялось 23 % ФИТЦ-положительных клеток. Добавление немеченого пептида в инкубационную смесь в избыточном количестве приводило к уменьшению количества ФИТЦ-положительных клеток. Данный эффект не наблюдался при добавлении другого пептида - тимогена: Glu-Trp. Это свидетельствует о том, что связывание изучаемого пептида с клетками-мишенями было специфическим. Полученные факты позволяют нам предполагать, что на лимфоидных клетках имеются рецепторы к данному соединению.
Таким образом, изучаемое соединение обладает выраженным иммуностимулирующим действием, оказывая влияние преимущественно на В-клеточное звено иммунитета. На наш взгляд, клетками-мишенями для него являются лимфоциты, находящиеся на различных стадиях онтогенеза - начиная от клеток-предшественников и заканчивая зрелыми антителопродуцентами. Расшифровка структуры, синтез и изучение механизмов действия индивидуальных пептидов бурсы Фабрициуса открывают перспективу для разработки лекарственных средств нового поколения, производящих направленную коррекцию поврежденных звеньев иммунитета.
Таблица 2
Влияние пептида на индуктивную и продуктивную фазы иммунного ответа у эмбрионально бурсэктомированных цыплят Ме (25-75 процентиль)
|
Изучаемые показатели |
Ложно-оперированные цыплята (n = 20) |
Бурсэктомированные цыплята |
|||
|
индуктивная фаза |
продуктивная фаза |
||||
|
физ. раствор (контроль) (n = 19) |
пептид (n = 18) |
физ. раствор (контроль) (n = 18) |
пептид (n = 17) |
||
|
Титр гемаг-глютининов, log2 |
6,15 (5,34-6,89) |
0,95 (0,68-1,14) p1 < 0,001 |
2,61 (2,38-3,09) p2?< <? 0,001 |
0,78 (0,56-1,08) p1 < 0,001 |
1,21 (0,94-1,42) p2 > 0,05 |
|
Титр гемолизинов, log2 |
3,85 (3,12-4,45) |
1,21 (1,03-1,42) p1 < 0,001 |
3,06 (2,74-3,41) p2 < 0,001 |
1,33 (1,12-1,55) p1 < 0,001 |
1,68 (1,32-1,89) p2 > 0,05 |
|
АОК селезенки, ×103 |
14,15 (12,03-16,12) |
4,84 (3,92-5,67) p1 < 0,001 |
8,67 (7,14-9,87) p2 < 0,001 |
3,61 (2,92-4,27) p1 < 0,001 |
4,74 (3,90-5,34) p2 > 0,05 |
Примечание (статистическая значимость различий): p1 - между ложнооперированными и бурсэктомированными цыплятами; p2 - между бурсэктомированными цыплятами, получавшими физ. раствор и пептид.
Выводы
1. Из ткани бурсы Фабрициуса выделен и синтезирован биологически активный пептид, имеющий структурную формулу: Trp-Thr-Ala-Glu-Glu-Lys-Gln-Leu.
2. В культуре лимфоцитов онкологических больных изучаемый пептид стимулирует экспрессию дифференцировочных антигенов Т-, В-лимфоцитов и NK-клеток (CD2, CD3, CD4, CD16, CD25, CD21, CD22, CD23, IgM).
3. При эмбриональной бурсэктомии пептид стимулирует иммунный ответ на Т-зависимый антиген в индуктивную фазу, что выражается в увеличении титра гемагглютининов, гемолизинов и количества антителообразующих клеток в селезенке.
Рецензенты:
Намоконов Е.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой общей хирургии ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия», г. Чита;
Малежик Л.П., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия», г. Чита.
Работа поступила в редакцию 26.11.2012.