Развитие медицинской энзимологии в XXI веке касается разработки нового направления супрамолекулярной регуляции свойств ферментов, связанных с мембранными структурами клеток [9, 12]. Данные исследования открывают широкие перспективы для создания новых эффективных надмолекулярных маркеров ранней диагностики различных патологических состояний человека. Характерно, что до сих пор, в силу экстремальных условий жизни человека в современном техногенном мире, актуальной остается проблема термических поражений [1]. Несомненно, что именно ранняя диагностика тяжести повреждения организма при ожоговой болезни позволит назначить своевременное лечение и провести эффективную профилактику возможных осложнений. Поэтому фундаментальные исследования в области медицинской энзимологии всецело направлены на выявление новых энзиматических маркеров диагностики тяжести патологического процесса при ожоговой болезни у человека.
Среди всего разнообразия различных ферментов, в частности эритроцитов, обращают на себя внимание два: лактатдегидрогеназа (ЛДГ), как один из основных ферментов гликолиза, и альдегиддегидрогеназа (АлДГ) - фермент биотрансформации ксенобиотиков альдегидной природы. Оба фермента взаимодействуют с мембраной эритроцитов, что позволяет рассматривать возможность их мембранной регуляции при различных состояниях организма, в частности при термическом поражении [7, 8].
Целью настоящего исследования явилось изучение активности и кинетических свойств ЛДГ и АлДГ мембран эритроцитов при термической травме у человека.
Материал и методы исследования
Исследования проводили на практически здоровых людях (n = 15) и пациентах с термической травмой (n = 15; площадь поражения - 20 % поверхности тела, тяжесть - III А, Б степень). Кровь брали из локтевой вены, стабилизировали ее 4 %-м раствором цитрата натрия (в соотношении 9:1) с соблюдением всех необходимых правил в условиях медицинского стационара. Активность ЛДГ (с использованием в качестве субстрата молочной кислоты) и АлДГ (с использованием в качестве субстрата ацетальдегида) определяли в «тенях» эритроцитов [4, 5]. Для получения «теней» эритроциты осаждали (800 g; 10 мин), промывали 5-кратным объемом 0,15 М NaCl с 10 мМ трис-HCl (pH 7,4), гемолизировали, через 30 мин центрифугировали (16000g; 10 мин) [6]. Также определялись следующие кинетические показатели ферментов: Kt, Vmax и Ka [2], где Kt - интегративный показатель сродства фермента к субстратам реакции (мин); Vmax - максимальная скорость реакции фермента (мкмоль/мин); Ka (Vmax/Kt) - коэффициент каталитической эффективности ферментативной реакции (мкмоль/мин2). Статистический анализ результатов исследований выполнен с использованием программы Statistica 6.
Результаты исследования и их обсуждение
Проведенные исследования показали, что у здоровых людей в мембранах эритроцитов активность альдегиддегидрогеназы преобладает по сравнению с активностью лактатдегидрогеназы в 1,5 раза. Однако при термической травме имеет место противоположная картина, когда активность ЛДГ в «тенях» эритроцитов превышает активность альдегиддегидрогеназы в 2,7 раз (табл. 1). Отмечено, что при ожоге активность лактатдегидрогеназы статистически значимо увеличивается в 2 раза по сравнению со здоровыми людьми, активность альдегиддегидрогеназы снижается в 2 раза.
Таблица 1
Активность ферментов (нмоль НАДН/минЧбелка) в «тенях» эритроцитов при термической травме
|
Ферменты |
ЛДГ |
АлДГ |
|
Здоровые люди |
18,09 ± 0,95 |
27,73 ± 1,46 |
|
Больные с ожогом |
36,17 ± 1,90* p = 0,0012 |
13,26 ± 0,70* p = 0,0023 |
Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению со здоровыми людьми.
Для того чтобы представить возможный молекулярный механизм данных перестроек в активности ферментов, были изучены их кинетические характеристики. При рассмотрении кинетических показателей обращает на себя внимание то, что при термической травме сродство ЛДГ к субстратам реакции практически не изменяется, статистически значимо увеличивается только максимальная скорость реакции в 1,8 раза. Каталитическая эффективность фермента повышается (табл. 2).
Таблица 2
Кинетические свойства ферментов в «тенях» эритроцитов при термической травме
|
Ферменты |
Кинетические показатели |
ЛДГ |
АлДГ |
|
Здоровые люди |
Kt, мин |
2,62 ± 0,14 |
4,37 ± 0,23 |
|
Vmax, (мкмоль/мин) |
0,83 ± 0,04 |
1,81 ± 0,10 |
|
|
Ka, (мкмоль/мин2) |
0,32 ± 0,02 |
0,41 ± 0,02 |
|
|
Больные с ожогом |
Kt, мин |
2,60 ± 0,14 |
1,78 ± 0,09* p = 0,0042 |
|
Vmax, (мкмоль/мин) |
1,53 ± 0,08* p = 0,0054 |
0,49 ± 0,02* p = 0,0051 |
|
|
Ka, (мкмоль/мин2) |
0,58 ± 0,03* p = 0,0132 |
0,28 ± 0,01* p = 0,0063 |
Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению со здоровыми людьми.
Для АлДГ при термической травме характерно, с одной стороны, увеличение сродства к субстратам реакции по сравнению со здоровыми людьми (Kt, статистически значимо снижается в 2,5 раза). С другой стороны, Vmax ферментативной реакции альдегиддегидрогеназы существенно падает в 4,4 раза. Закономерно, что каталитическая эффективность данного фермента при термической травме уменьшается в 1,5 раза по сравнению со здоровыми людьми (табл. 2).
Основываясь на данных литературы и ранее проведенных исследованиях, на первый план выходит объяснение полученных результатов с позиции регуляторного влияния мембраны на свойства ферментов эритроцитов [3, 10].
Предполагается, что АлДГ и ЛДГ оказывают влияние друг на друга при взаимодействии с мембраной эритроцита, которое можно выявить при рассмотрении кинетического взаимодействия ферментов. Видимо, в эритроцитах здоровых людей альдегиддегидрогеназа выступает в роли ингибитора ЛДГ по бесконкурентному кинетическому механизму. При этом мембрана эритроцитов играет роль основного регулятора функционального взаимодействия ферментов друг с другом. При термической травме картина изменяется. В данном случае ЛДГ оказывает псевдоингибирующее воздействие на АлДГ эритроцитарной мембраны.
Таким образом, на основании проведенных кинетических исследований можно заключить, что ЛДГ и АлДГ эритроцитов взаимодействуют не только с мембраной эритроцитов, но и функционально связаны друг с другом единым для обеих реакций коферментом никотинамидадениндинуклеотидом (НАД). Причем характер данного взаимодействия зависит от физико-химического состояния мембраны эритроцитов. Если целостность мембраны сохранена, то АлДГ оказывает ингибирующее влияние на активность лактатдегидрогеназы. Если же мембрана эритроцитов повреждена, что имеет место в условиях окислительного стресса при термической травме, изменяются ее физико-химические свойства [11]. В результате такой перестройки мембраны характер функционального взаимодействия ферментов друг с другом нарушается. В итоге ЛДГ оказывает ингибирующее воздействие на АлДГ в поврежденных мембранах эритроцитов. Несомненно, что это только одно из множества возможных объяснений полученных результатов. Дальнейшие исследования прольют свет на особенности мембранной регуляции ферментов клеток не только в условиях физиологической нормы, но и при патологии, в частности термической травме.
Рецензенты:
Корягин А.С., д.б.н., профессор кафедры физиологии и биохимии человека и животных ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород;
Веселов А.П., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биохимии и физиологии растений, декан биологического факультета ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И.Лобачевского», г. Нижний Новгород.
Работа поступила в редакцию 09.11.2012.