Хронические гепатиты и циррозы печени занимают ведущее место в структуре патологии печени [4]. В последние годы в гепатологии достигнуты большие успехи как в отношении методов лабораторной и инструментальной диагностики циррозов, так и в направлении лечебных мероприятий. Однако сложность строения печени и многообразие её функций обуславливают необходимость применения разнообразных диагностических приёмов и методологических подходов к оценке её деятельности в норме, при патологии и лечении. Высокой информативностью при изучении этих явлений обладает метод определения активности ядрышковых организаторов путем окрашивания тканей 50 % коллоидным раствором нитрата серебра [1]. В окрашенных препаратах визуализируются ядрышки и интрануклеарные аргентаффинные белковые гранулы, ассоциированные с зонами нуклеолярной транскрипции. Этот метод может объективно отражать степень напряженности рибосомального синтеза и пролиферативной активности различных клеток [1, 2].
Целью данного исследования явилось изучение показателей активности ядрышковых организаторов в гепатоцитах крыс при токсическом циррозе печени и после лечения препаратами фетальной печени, хорионическим гонадотропином и гепатозащитным препаратом «Максар».
Материалы и методы исследования
Эксперимент проведен на половозрелых крысах-самцах массой от 180 до 220 г в количестве 71 особь. Животные были разделены на 6 групп. I–V опытные группы составили животные, которым подкожно вводили 50 % масляный раствор CCl4 в дозе 0,1 мл 3 раза в неделю в течение 2-х месяцев. Животные VI группы – интактные. Через 2 месяца I-й опытной группе после возникновения у них цирроза печени вводили экстракт фетальной печени человека; II опытной группе – клеточную суспензию фетальной печени человека; III опытной группе – хорионический гонадотропин человека; IV опытной группе – растительный препарат «Максар» (экстракт Маакии амурской), который был любезно предоставлен ведущим научным сотрудником С.А. Федореевым (Тихоокеанский ин-т биоорган. химии ДВО РАН).
Источником фетальной печени человека служили остатки абортного материала, полученные в результате самопроизвольных выкидышей, а также при вызывании преждевременных родов по социальным показаниям (20–22 недельного срока внутриутробного развития плода). Время, проходившее от момента взятия фетальной печени до эксплантации в организм животных, не превышало 4-х часов. В стерильных условиях извлекали печень, в небольшом объеме раствора Рингера рассекали на фрагменты. Затем готовили 10 % гомогенат путем центрифугирования фрагментов печени в растворе Рингера при 5000 об/мин в течение 10 минут. Полученный экстракт фетальной печени человека сразу же вводили крысам, подвергшимся интоксикации, по 1,5 мл каждой 1 раз в неделю в течение 2 недель. Клеточную суспензию фетальной печени готовили следующим способом: извлечённую печень в небольшом объеме раствора Рингера рассекали на фрагменты, разводили раствором Рингера до 10 % по массе взятой навески печени, затем добавляли коллагеназу и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Далее пипетировали иглами уменьшающегося диаметра, добавляли раствор Рингера, вновь пипетировали. После центрифугирования супернатант сливали, к осадку добавляли раствор Рингера, снова пипетировали и центрифугировали при тех же условиях. Таким путем отмывали раствор от коллагеназы еще несколько раз. После последнего центрифугирования супернатант сливали, к осадку добавляли первоначальный объем раствора Рингера, пипетировали и вводили по 1,5 мл полученной клеточной суспензии внутрибрюшинно каждой крысе, подвергшейся интоксикации, 1 раз в неделю в течение 2 недель. Хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) при лечении вводили внутрибрюшинно 3 дня подряд по 1,5 мл раствора, полученного при разведении ампул по 500 ЕД физраствором из расчета 170 ЕД на животное. Раствор «Максара» готовили следующим образом: к 1 г сухого препарата добавляли 5 мл 96 % этилового спирта и 45 мл дистиллированной воды, перемешивали, полученную взвесь вводили животным перорально под лёгким эфирным наркозом из расчёта 1 мл на 100 г веса 1 раз в неделю в течение 2 недель. Материал печени нелеченных и интактных животных забирали на забое через 4 недели после прекращения введения CCl4, а леченных – через 2 недели после окончания лечения. Забой животных проводили под эфирным наркозом.
Ядрышковые организаторы в гепатоцитах выявляли в парафиновых срезах печени крыс [3]. Оценку активности ядрышковых организаторов проводили при увеличении ?1000 с масляной иммерсией и зеленым светофильтром, используя микроскоп «JЕNAMED-2» [8]. Для анализа было взято 20 клеток для каждого животного. В гепатоцитах подсчитывали число ядрышек, интрануклеолярных и экстрануклеолярных включений, а также сумму аргентаффинных гранул и нуклеолярные индексы, вычисляемые как отношение числа ядрышек к числу интрануклеолярных аргентафинных включений. С целью оценки процессов пролиферации производили подсчет числа гепатоцитов 1-го и 2-го типа. В гепатоцитах 1-го типа выявляли аргентаффинные внутриядрышковые включения или диффузно окрашенные ядрышки. Такое распределение включений наблюдается в непролиферирующих клетках [1]. В гепатоцитах 2-го типа визуализировались не только целиком прокрашенные ядрышки и депозиты внутри них, но и диспергированные в кариоплазме аргентаффинные белковые гранулы, т.е. экстрануклеолярные включения. Такой тип распределения аргентаффинных гранул характерен для пролиферирующих клеток. Полученные данные в абсолютных значениях подвергали обработке приемами вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по критерию t Стьюдента и χ2.
Результаты исследования и их обсуждение
Через 2 месяца после введения CCl4 у крыс развился цирроз печени, который морфологически проявлялся отсутствием типичных печеночных долек и диффузным разрастанием соединительной ткани. Паренхима печени состояла из ложных печеночных долек, регистрировалась диффузная и зональная жировая дистрофия гепатоцитов. В портальных трактах наблюдалось разрастание фиброзной ткани, диффузная лимфоцитарная и гистиоцитарная инфильтрация. Лечение сопровождалось появлением типичных печеночных долек, представленных несколько увеличенными в размерах гепатоцитами с гиперхромными ядрами, пронизанными соединительно-тканными прослойками. В печеночных дольках после лечения была отмечена обычная радиарная ориентация печеночных балок. Результаты определения активности ядрышковых организаторов в эксперименте представлены в табл. 1, 2.
Рассматривая данные по активности ядрышковых организаторов в экспериментах с интоксикацией CCl4, вызывающей цирротические изменения в печени, и последующим лечением (табл. 1), можно выделить ряд закономерностей. Не вызывает сомнения факт, что активность ядрышковых организаторов в гепатоцитах крыс с циррозом печени нарастает в результате действия гепатотоксичного яда CCl4. Такое явление даже на фоне достаточно выраженной жировой, вакуольной и других видов дистрофии свидетельствует об известной способности гепатоцитов резко интенсифицировать гиперпластические процессы в их ультраструктурах в ответ на повреждающее воздействие [6]. Это говорит о том, что организму в высшей степени свойственна способность к экономии материальных ресурсов и к максимальной концентрации их на главном участке развёртывания приспособительной реакции [6]. Количество ядрышек при хронической интоксикации CCl4 возрастает более чем в 2 раза по сравнению с контролем. Возможно, что увеличение их числа при циррозе печени происходит за счёт активации ЯОР, которые ранее были неактивными и не выявлялись методом серебрения [7]. Абсолютное число интрануклеолярных включений также возрастает, однако нуклеолярный индекс остаётся практически неизменным, что говорит об одинаковом количестве интрануклеолярных включений, приходящемся на отдельное ядрышко как в норме, так и при циррозе. Это согласуется с представлениями о том, что репаративная регенерация печени протекает в равной степени в двух формах – клеточной и внутриклеточной [6].
Таблица 1
Число ядрышек, интрануклеолярных и экстрануклеолярных аргентафинных гранул и отношение числа ядрышек к числу интрануклеолярных аргентафинных гранул в гепатоцитах у крыс
|
Экспериментальные группы |
Абсолютное число ядрышек на гепатоцит |
Абсолютное число интрануклеолярных включений на гепатоцит |
Абсолютное число экстрануклеолярных включений на гепатоцит |
Суммарное число включений на гепатоцит |
Отношение числа ядрышек к числу интрануклеолярных включений |
|
I (n = 260) |
5,13 ± 0,09*** |
26,34 ± 0,53*** |
1,13 ± 0,11*** |
27,45 ± 0,52*** |
0,20 ± 0,006*** |
|
II (n = 260) |
4,70 ± 0,09*** |
22,91 ± 0,49*** |
0,92 ± 0,11*** |
23,81 ± 0,47** |
0,21 ± 0,007*** |
|
III(n = 280) |
2,95 ± 0,07* |
15,98 ± 0,54*** |
0,49 ± 0,06*** |
16,46 ± 0,51*** |
0,19 ± 0,008*** |
|
IV(n = 240) |
2,96 ± 0,07* |
15,63 ± 0,37*** |
0,61 ± 0,06*** |
16,25 ± 0,35*** |
0,19 ± 0,003*** |
|
V (n = 200) |
6,92 ± 0,34** |
18,29 ± 0,99** |
3,74 ± 0,21** |
22,03 ± 1,17** |
0,38 ± 0,016 |
|
VI (n = 180) |
3,07 ± 0,12 |
7,98 ± 0,25 |
0,28 ± 0,03 |
8,27 ± 0,26 |
0,39 ± 0,004 |
Примечание: группа I – лечение экстрактом фетальной печении (20–22 нед. гестации); группа II – лечение клеточной суспензией фетальной печени (20–22 нед. гестации); группа III – лечение хорионическим гонадотропином человека; группа IV – лечение препаратом «Максар»; группа V – интоксикация CCl4 без лечения; группа VI – интактные животные; n – общее количество исследованных гепатоцитов в группе; * – достоверные различия обнаружены в группах I–IV по отношению к V группе (p < 0,05); ** – достоверные различия обнаружены в группах I–V по отношению к VI группе (p < 0,05).
Таблица 2
Число гепатоцитов 1-го и 2-го типов у крыс
|
Группа крыс |
Число гепатоцитов 1-го типа |
Число гепатоцитов 2-го типа |
Всего |
|
I |
168 (64,6 %) |
92 (35,4 %) |
260 (100,0 %) |
|
II |
193 (74,2 %) |
67 (25,8 %) |
260 (100,0 %) |
|
III |
216 (77,1 %) |
64 (22,9 %) |
280 (100,0 %) |
|
IV |
171 (71,3 %) |
69 (28,7 %) |
240 (100,0 %) |
|
V |
8 (4,0 %) |
192 (96,0 %) |
200 (100,0 %) |
|
VI |
144 (80,0 %) |
36 (20,0 %) |
180 (100,0 %) |
Примечание: нумерация экспериментальных групп такая же, как и в табл. 1; выявлены достоверные отличия между I, II, III, IV, VI группами по отношению к V группе (?2 (p < 0,0001)).
При лечении во всех группах отмечалось резкое снижение числа ядрышек, в случаях лечения ХГЧ и «Максаром» с достижением контрольных отметок, что коррелирует со снижением пролиферативной активности клеток [1, 7]. В то же время уменьшение числа интрануклеолярных включений было не так значительно, а в случаях лечения экстрактом и клеточной суспензией фетальной печени количество интрануклеолярных включений даже несколько возросло по сравнению с интоксикацией. Тем не менее, расчёт нуклеолярных индексов показал близость их значений для всех групп лечения, что свидетельствует о едином росте числа интрануклеолярных включений, приходящегося на отдельное ядрышко. Данные изменения происходят, по всей видимости, за счёт рекомбинационных преобразований аргентаффинного вещества ядрышек. Увеличение зоны фибриллярных центров приводит к интенсификации рибосомального синтеза в зонах нуклеолярной транскрипции гепатоцитов. Таким образом, при лечении происходит интенсификация процессов внутриклеточной регенерации, в то время как пролиферативная активность снижается. С этими данными согласуется изменение распределения гепатоцитов по типам (табл. 2). При лечении количество экстрануклеолярных включений и клеток 2-го типа снижается по сравнению с интоксикацией и стремится к контрольным значениям.
Мы считаем, что такой положительный терапевтический эффект, вероятно, обусловлен появлением в гепатоцитах белков, блокирующих их пролиферативный потенциал, в то время как биосинтетические процессы остаются на высоком уровне, а в случае лечения препаратами фетальной печении даже интенсифицируются. Таким образом, по данным показателям можно говорить о наличии положительного терапевтического эффекта при лечении всеми способами, однако в сравнительном аспекте можно отметить более сильное модулирующее действие препаратов фетальной печени, проявляющееся в сохранении и увеличении количества белков-регуляторов, ассоциированных с зонами нуклеолярной транскрипции.
Вывод
Таким образом, исследования показали, что печень интактных и леченных крыс состоит главным образом из гепатоцитов I типа (с низкой пролиферативной активностью), в то время как у нелеченных крыс – из гепатоцитов II типа (с высокой пролиферативной активностью). Модулирующее действие лекарственных препаратов позволяет снизить опасность образования неконтролируемого пула пролиферирующих клеток и способствует направлению репаративных процессов в сторону внутриклеточной регенерации гепатоцитов.
Работа выполнена при финансовой поддержке по гранту ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (соглашение № 8275).