Биотехнологии природных сахарозаменителей нового поколения с пребиотическими свойствами, способствующих поддержанию иммунной системы человека, регулируя кишечную микрофлору и индуцируя полезные эффекты не только на уровне желудочно-кишечного тракта, но и организма в целом, – одно из основных направлений исследований в области нутрициологии [1, 5].
Изомальтулоза (6-О-α-D-глюкопиранозид-D-фруктоза) – натуральный заменитель сахара, незначительно распространенный в природе, который присутствует в меде и соке сахарного тростника. Сахарозаменитель рекомендован для создания продуктов диетического и диабетического питания, а также продуктов функционального назначения [6]. Сотрудниками кафедры микробиологии и биохимии ФГБОУ ВПО «ВГУИТ» разработана биотехнология трансформации сахарозы в изомальтулозу ферментом изомальтулозосинтазой с применением иммобилизованных клеток бактерий Erwinia rhapontici [3]. Однако пребиотические свойства изомальтулозы изучены не достаточно. Проведенные исследования показали, что культивирование бифидобактерий Bifidobacterium bifidum в условиях in vitro на среде, содержащей изомальтулозу, отличается высокой активностью их роста, уровнем накопления биомассы, продукцией органических кислот, по сравнению с контролем (среда с сахарозой), что косвенно свидетельствует о пребиотических свойствах данного заменителя сахара [2]. Однако данные о способности представителей нормофлоры кишечника животных активно развиваться на среде с изомальтулозой в условиях in vivo отсутствуют.
Цель работы состояла в исследовании пребиотических свойств изомальтулозы, полученной с помощью иммобилизованных бактериальных клеток E. rhapontici, в условиях in vivo на белых беспородных мышах.
Материал и методы исследования
В качестве экспериментальных животных использовали белых беспородных мышей массой 20 ± 2 г. В соответствии с планом эксперимента были сформированы 4 группы животных по 15 особей в каждой. Экспериментальные животные находились в свободном режиме существования и в пищу получали раствор изомальтулозы. Доступ к воде был свободный. Исследования просветной микрофлоры выполняли, анализируя по 3 пробы асептически взятых фекальных масс от 5 мышей. С целью более полного изучения бифидогенных свойств изомальтулозы испытаны возрастающие дозы препарата, вводимые мышам. Оптимальная дозировка изомальтулозы в количестве 0,5 мл по нарастанию массы тела в течение 7 суток установлена экспериментально при пероральном введении сахарозаменителя.
Микрофлору кишечника экспериментальных животных исследовали по общепринятой стандартной методике, руководствуясь нормами, приведенными в монографии Шендерова Б.А. [4]. Для выращивания микроорганизмов и определения физиолого-биохимических свойств использовали дифференциально-диагностические питательные среды.
Выделение бактерий из патологического материала и идентификацию штаммов проводили общепринятым методом с использованием соответствующих стандартизированных дифференциально-диагностических сред (кровяной агар, агар Клиглера, среда Кларка, фенилаланиновый агар, МРС-4, среда Сабуро, среда Плоскирева, среда Симмонса, среда с лизином, среда Эндо, среда Блаурокка, солевой агар для выращивания стафилококков, среда для выращивания клостридий, энтерококковый агар). Для создания условий экспериментального дисбиоза опытным животным вводили антибиотик доксициклин гидрохлорид (ОАО «Белмедпрепараты) в дозировке, рекомендуемой по инструкции препарата.
Опыты проводили в 3-кратной биологической повторности. В таблицах и на рисунках приведены данные типичных опытов, где каждое значение есть среднее арифметическое. При математической обработке использовали статистический критерий Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
С целью изучения пребиотических свойств изомальтулозы в условиях in vivo проведено исследование исходной нормофлоры белых беспородных мышей, полученных из питомника «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» (г. Москва).
Для определения оптимальной дозировки изомальтулозы при пероральном введении варьировали диапозон значений сахарозаменителя от 0,075 до 0,6 мг на мышь. Основным критерием оценки данного исследования служило нарастание массы тела животного в течение 7 суток. Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Определение оптимальной дозировки изомальтулозы на белых беспородных мышах
|
Наименование препарата |
Дозировка, мг |
Метка |
Динамика изменения массы тела мышей, г |
Показатель |
||||||
|
сутки |
||||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
|
Изомальтулоза |
0,075 |
Гол. |
20,2 |
20,0 |
20,7 |
21,1 |
21,6 |
21,9 |
22,2 |
0,76 |
|
Хв. |
22,4 |
21,3 |
21,9 |
21,6 |
22,2 |
22,3 |
22,5 |
|||
|
П.л. |
18,2 |
18,5 |
18,7 |
19,4 |
19,4 |
19,4 |
19,5 |
|||
|
З.л. |
19,1 |
19,2 |
19,8 |
19,4 |
19,4 |
19,5 |
19,7 |
|||
|
Чист. |
20,6 |
21,5 |
20,7 |
21,5 |
21,8 |
22,2 |
22,4 |
|||
|
0,15 |
Гол. |
19,2 |
20,0 |
20,1 |
20,5 |
21,9 |
22,3 |
22,4 |
1,5 |
|
|
Хв. |
20,8 |
21,9 |
21,9 |
22,3 |
21,7 |
21,8 |
22,3 |
|||
|
П.л. |
22,2 |
23,0 |
22,8 |
22,9 |
23,8 |
23,9 |
24,0 |
|||
|
З.л. |
21,8 |
22,4 |
22,8 |
23,5 |
23,5 |
23,6 |
23,8 |
|||
|
Чист. |
22,0 |
23,3 |
23,0 |
23,5 |
23,1 |
23,3 |
23,6 |
|||
|
0,3 |
Гол. |
22,1 |
19,6 |
22,9 |
23,4 |
23,0 |
23,1 |
23,4 |
1,6 |
|
|
Хв. |
22,5 |
20,8 |
24,0 |
24,4 |
25,7 |
25,8 |
26,1 |
|||
|
П.л. |
21,3 |
19,7 |
21,1 |
21,3 |
21,4 |
21,5 |
21,7 |
|||
|
З.л. |
19,6 |
20,6 |
20,7 |
21,2 |
21,5 |
21,7 |
21,8 |
|||
|
Чист. |
19,9 |
21,1 |
21,0 |
20,7 |
21,3 |
21,5 |
21,8 |
|||
|
0,6 |
Гол. |
21,5 |
21,6 |
21,3 |
21,3 |
21,4 |
21,5 |
21,7 |
1 |
|
|
Хв. |
22,2 |
23,9 |
23,3 |
24,3 |
23,7 |
23,8 |
24,0 |
|||
|
П.л. |
22,2 |
23,6 |
23,6 |
23,9 |
24,1 |
24,3 |
21,6 |
|||
|
З.л. |
22,9 |
23,4 |
22,4 |
24,0 |
23,4 |
24,5 |
24,8 |
|||
|
Чист. |
21,1 |
22,2 |
21,9 |
21,9 |
21,0 |
21,2 |
21,5 |
|||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
|
Контроль |
Интактные |
Гол. |
20,3 |
20,4 |
20,1 |
20,3 |
20,5 |
20,6 |
20,8 |
0 |
|
Хв. |
22,8 |
22,3 |
23,1 |
23,3 |
23,6 |
23,7 |
23,7 |
|||
|
П.л. |
22,9 |
24,1 |
22,6 |
23,6 |
23,7 |
23,7 |
23,9 |
|||
|
З.л. |
22,9 |
23,4 |
22,4 |
24,0 |
24,1 |
24,2 |
24,4 |
|||
|
Чист. |
21,1 |
22,2 |
21,9 |
21,9 |
22,0 |
22,2 |
22,3 |
|||
Примечание. Гол – голова; Хв – хвост; П.л. – передние лапки; З.л. – задние лапки; Чист – чистый вес.
Анализируя данные табл. 1, установили, что при использовании дозировки сахарозаменителя в количестве от 0,075 до 0,3 мг на особь наблюдается значительный прирост массы тел животных относительно контрольной группы. При дальнейшем увеличении количества потребляемой изомальтулозы этот показатель изменяется незначительно во всех группах. Оптимальная дозировка изомальтулозы, при которой показатель увеличения массы тела достигает максимального значения – 1,6, составляет 0,3 мг на мышь. Проведенные исследования состава микрофлоры при введении в рацион животных препарата изомальтулозы в этой дозировке показали, что качественный и количественный состав микрофлоры кишечника контрольной и опытной групп животных аналогичен. Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2
Характеристика микрофлоры мышей на фоне изомальтулозы
|
Наименование микроорганизмов |
Норма |
Здоровые мыши |
Здоровые мыши, получавшие |
|
E. coli lac- |
106 |
107 |
106-107(1обр. lac +) |
|
E. coli lac + |
107(2обр.) |
||
|
E. faecalis |
104 |
107 |
106-107 |
|
E. faecium |
104 |
107 |
108 |
|
S. aureus |
104 |
105 |
0(1 обр.)-105 |
|
E.ictaluri |
- |
106 |
- |
|
Clostridium |
≤ 103 |
105 |
104-105 |
|
Bifidobacterium |
≤ 103 |
103 |
103 |
|
Lactobacterium |
1010 |
0(2 обр.)-1010 |
0(2 обр.)-1010 |
|
P. mirabilis |
104 |
0(1 обр.)-107 |
- |
|
S. cohnii subsp. urealiticus |
104 |
0(1 обр.)-107 |
- |
|
S. epidermidis |
104 |
0(2 обр.)-107 |
- |
|
Bacillus spp. |
104 |
0(2 обр.)-106 |
- |
|
C.pseudodiphteriticum |
≤ 103 |
- |
- |
|
Acinetobacter |
- |
- |
107 |
|
C.albicans |
103 |
- |
106(2обр.)-104 |
Как видно из табл. 1, пероральное введение изомальтулозы белым беспородным мышам способствует увеличению количества энтерококков Е. faecium, входящих в состав нормальной микрофлоры пищеварительного тракта, Acinetobacter и дрожжеподобных грибов C. albicans, что положительно влияет на гомеостаз животных. Важно отметить, что потребление изомальтулозы снижает количество бактерий р.р. Strep-
tococcus, Proteus, Ewingella (E. ictaluri) – представителей условно-патогенной микрофлоры. Отличия в количестве лактобактерий и бифидобактерий не наблюдалось.
Результаты исследований по изучению влияния изомальтулозы на видовой состав микрофлоры кишечника белых мышей в условиях экспериментального дисбиоза представлены в табл. 3.
Сравнивая состав микрофлоры животных III и IV групп, можно отметить его количественное различие. У животных с экспериментальным дисбиозом, получавших изомальтулозу, наблюдается восстановление количества бактерий группы кишечной палочки (E. coli lac +), энтерококков (E. faecalis, E. faecium), бактерий р.р. Streptococcus (S. aureus), Proteus (P. mirabilis) до уровня, соответствующего норме. Важным показателем, отражающим положительное влияние изомальтулозы на состав микрофлоры, является восстановление количества лактобактерий.
Таблица 3
Характеристика микрофлоры мышей, получавших изомальтулозу на фоне антибиотика
|
Наименование микроорганизмов |
Норма |
I группа |
II группа |
III группа |
IV группа |
|
E.coli lac- |
106 |
107 |
106-107(1обр. lac +) |
106-107 |
- |
|
E.coli lac + |
107(2обр.) |
- |
106 |
||
|
E.faecalis |
104 |
107 |
106-107 |
107 |
104 |
|
E.faecium |
104 |
107 |
108 |
107-108 |
104 |
|
S.aureus |
104 |
105 |
0(1 обр.)-105 |
0(2 обр.)-106 |
0(2 обр.)-104 |
|
E.ictaluri |
- |
106 |
- |
- |
- |
|
Clostridium |
≤ 103 |
105 |
104-105 |
105 |
105 |
|
Bifidobacterium |
≤ 103 |
103 |
103 |
103 |
103 |
|
Lactobacterium |
1010 |
0(2 обр.)-1010 |
0(2 обр.)-1010 |
- |
1011(2 обр.)-1010 |
|
P.mirabilis |
104 |
0(1 обр.)-107 |
- |
0(1 обр.)-107 |
- |
|
S.cohnii subsp. urealiticus |
104 |
0(1 обр.)-107 |
- |
- |
- |
|
S.epidermidis |
104 |
0(2 обр.)-107 |
- |
- |
- |
|
Bacillus spp. |
104 |
0(2 обр.)-106 |
- |
- |
- |
|
C.pseudodiphteriticum |
≤ 103 |
- |
- |
0(2 обр.)-104 |
- |
|
Acinetobacter |
- |
- |
107 |
- |
109 |
|
C.albicans |
103 |
- |
106(2обр.)-104 |
106 |
106 |
Примечания:
I группа – здоровые мыши;
II группа – здоровые мыши, получавшие по 0,3 мг изомальтулозы в течение 7 дней;
III группа – мыши с экспериментальным дисбиозом кишечника;
IV группа – мыши с экспериментальным дисбиозом, получавшие по 0,3 мг изомальтулозы на мышь в течение 7 дней.
Заключение
Изучение влияния изомальтулозы на микрофлору кишечника белых беспородных мышей в норме и при патологии показало положительное действие сахарозаменителя на нормализацию микрофлоры кишечника животных: увеличение количества молочнокислых бактерий, снижение числа представителей условно-патогенной микрофлоры. Сходство в строении и функционировании органов пищеварительной системы (желудка, тонкого и толстого кишечника, печени) человека и мыши дает основание считать, что пребиотическое действие изомальтулозы в условиях in vivo может иметь место и у человека.
Работа выполнялась в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы, государственный контракт № П1333 от 11.06.2010 г.