В настоящее время весьма актуальна проблема изучения токсичности 1,2 дихлорэтана (ДХЭ), так как частота отравления данным соединением в последнее десятилетие существенно увеличилась. ДХЭ широко используется в химической промышленности и в технологиях уничтожения токсичных химикатов [3, 4, 15]. Острые интоксикации ДХЭ, несмотря на их небольшую частоту (до 5 %), характеризуются высокой смертностью отравленных, составляя, по данным разных авторов, от 20 до 96 % [3, 6]. При сохраняющейся высокой летальности от острых интоксикаций ДХЭ основную массу составляют патологические состояния, наблюдаемые при длительном поступлении токсиканта в организм, когда явной клинической симптоматики может и не возникнуть. Изучение патогенеза токсического действия ДХЭ при его длительном поступлении в низких концентрациях, а также способов терапии является актуальной
задачей.
Развитие любого заболевания сопряжено с нарушением структурно-функциональных характеристик тех или иных клеток организма. В настоящее время недостаточно изучено состояние мембран при хронической интоксикации ДХЭ. В работах многих авторов установлена высокая степень корреляции изменений свойств мембран эритроцитов и клеточных мембран внутренних органов, что позволяет использовать эритроцитарные мембраны в качестве наиболее доступной модели для установления общих мембранных характеристик, так как ей присущи основные принципы молекулярной организации плазматических мембран [11, 12].
В рамках проблемы коррекции при хронической интоксикации ДХЭ остаются нерешенные научно-практические вопросы. Определенный интерес представляет метод лазерной терапии с использованием низкоэнергетических источников облучения. Лазерная терапия – высокоэффективный метод лечения, который вот уже более 30 лет успешно развивается как вполне самостоятельное направление современной медицины. В основе эффекта низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) лежит комплексное неспецифическое действие на организм, когда местные изменения вызывают смену уровня функционирования биосистем за счет формирования защитно-адаптивной реакции [1, 2, 7, 9]. Несмотря на широкое применение НИЛИ, многое в механизмах его действия остается неясным.
Целью исследования явилось изучение проницаемости и липидного спектра мембран эритроцитов у крыс при субхронической интоксикации ДХЭ до и после коррекции лазерным излучением.
Материалы и методы исследования
Эксперименты выполнены на 36 здоровых половозрелых неинбредных белых крысах-самцах массой 180–220 г, разделенных на 3 группы: 1-я – контрольная (n = 11), 2-я – животные с моделированной интоксикацией дихлорэтаном (n = 13), 3-я – животные, получавшие ДХЭ и НИЛИ (n = 12). Эксперименты проводились в соответствии с требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 10.10.83 г., № 267 МЗ РФ от 19.06.03 г. «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», «Правила по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных».
Субхроническая интоксикация дихлорэтаном достигалась ежедневным энтеральным введением токсиканта в дозе 5 мг/кг (0,01 LD 50) в течение 60 суток. Опытная группа крыс получала курс сочетанного воздействия импульсного НИЛИ с длиной волны 0,63 и 0,89 мкм. Использовался аппарат АЛТ «Матрикс» с зеркальной насадкой для воздействия в области печени контактной методикой (0,89 мкм, импульсная мощность 7 Вт, частота 80 Гц, доза – 0,01 Дж/см2) и аккупунктурной насадкой для надвенного облучения крови в области хвостовой вены (0,63 мкм, импульсная мощность 5 Вт, частота 80 Гц, доза 0,012 Дж/см2). Курс лазеротерапии начинали с 4-й недели и продолжали 14 дней. Объектом исследования служили эритроциты крыс. Тестирование осуществляли на 15, 30 и 60 сутки.
Проницаемость эритроцитарных мембран (ПЭМ) исследовали, определяя степень мочевинного гемолиза эритроцитов [14]. Для определения ПЭМ 100 мкл взвеси эритроцитов добавляли в 7 пробирок, содержащих по 5 мл рабочих смесей 1,8 % раствора мочевины и физиологического раствора в следующих соотношениях: 1-я пробирка (ПЭМ1) – 40:60, 2-я (ПЭМ2) – 45:55, 3-я (ПЭМ3) – 50:50, 4-я (ПЭМ) 55:45, 5-я (ПЭМ5) 60:40, 6-я (ПЭМ6) 65:35, 7-я (ПЭМ) содержала чистый раствор мочевины – эталон 100 % гемолиза. После инкубации в течение 3 минут при комнатной температуре и центрифугирования определяли осмотическую стойкость всех растворов при ? = 400 нм, пересчитывая этот показатель в процентах от эталона.
Экстракцию липидов из эритроцитов производили методом Блайя и Дайера в модификации Кейтса [5]. Фракции фосфолипидов (ФЛ) получали методом тонкослойной хромотографии [5, 8]. Количество отдельных фракций ФЛ определяли по содержанию липидного фосфора и выражали в процентах. Общие ФЛ вычисляли по сумме отдельных фракций. Холестерин (ХС) определяли по реакции с хлорным железом после экстракции изопропанолом [13].
Обработку полученных результатов проводили с применением методов вариационной статистики. После проверки нормальности распределения изучаемых параметров в сравниваемых группах определяли средние величины (М), ошибку средних величин (m). Оценку достоверности проводили по критерию Стьюдента (t). Минимальный уровень статистической значимости различий верифицировали при р < 0,05. Математическую обработку выполняли на компьютере с применением программного обеспечения Microsoft Excel.
Результаты исследования и их обсуждения
Как показали проведенные исследования, представленные в табл. 1, во всех растворах мочевины наблюдались достоверные различия между группами животных. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эритроциты крыс на 15 сутки интоксикации ДХЭ характеризуются меньшей резистентностью к гемолитическому воздействию мочевины и повышенной проницаемостью. Существенные различия показателей выявлены в III, IV, V разведениях мочевины. Такие изменения этого показателя объясняются, по-видимому, интенсификацией свободнорадикального окисления, что было показано нами ранее. Избыточное образование свободных радикалов, накопление первичных и вторичных продуктов липидной пероксидации ослабляет гидрофобные связи клеточных мембран. Понижение гидрофобности мембран клеток связано с увеличением содержания гидрофильных углеводородных хвостов, что, в свою очередь, ведет к вытеснению последних из толщи мембраны к ее поверхности и вызывает появление в мембране своеобразных пор.
На 30 сутки интоксикации ДХЭ проницаемость эритроцитарных мембран достоверно ниже нормы. По мере углубления тяжести интоксикации на 60 сутки эксперимента наблюдается дальнейшее снижение ПЭМ в III, IV, V и VI разведениях мочевины, что свидетельствует о глубоких структурных изменениях клеточных мембран –
переходу от их высокой проницаемости к патологическому уплотнению.
Результаты, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что при субхронической интоксикации ДХЭ на 60 сутки эксперимента в эритроцитах возрастает содержание холестерина и незначительно снижается количество общих фосфолипидов. Содержание холестерина в мембранах эритроцитов увеличивается на 62,7 % (р < 0,001), а степень снижения общих фосфолипидов составила 3,1 % (р > 0,05) по сравнению с данными контрольной группы. Значение коэффициента ХС/ФЛ при интоксикации ДХЭ возрастает на 67,4 % (р < 0,001) по сравнению с группой интактных животных. Повышение содержания холестерина в мембранных липидах приводит к увеличению вязкости мембранного бислоя путем ограничения подвижности жирнокислотных цепей в связи с его кластеризацией, а также повышает степень упаковки фосфолипидов. Все это ведет к уплотнению мембраны.
Таблица 1
Проницаемость мембран эритроцитов у крыс при субхронической интоксикации дихлорэтаном
|
Показатель |
Статистические |
Животные 1-й группы (n = 12) |
Длительность интоксикации дихлорэтаном у животных 2-й группы (n = 12) |
||
|
15 суток |
30 суток |
60 суток |
|||
|
ПЭМ 1, % |
M ± m Р |
3,1 ± 0,1 |
3,3 ± 0,2 > 0,05 |
0,8 ± 0,1 < 0,001 |
1,3 ± 0,2 < 0,001 |
|
ПЭМ 2, % |
M ± m Р |
3,9 ± 0,2 |
4,5 ± 0,2 > 0,05 |
1,1 ± 0,1 < 0,001 |
1,8 ± 0,1 < 0,001 |
|
ПЭМ 3, % |
M ± m Р |
7,6 ± 0,5 |
10,3 ± 0,7 < 0,01 |
2,8 ± 0,4 < 0,001 |
4,6 ± 0,2 < 0,01 |
|
ПЭМ 4, % |
M ± m Р |
15,4 ± 1,9 |
28,1 ± 3,2 < 0,01 |
10,1 ± 1,6 > 0,05 |
6,5 ± 0,4 < 0,001 |
|
ПЭМ 5, % |
M ± m Р |
50,6 ± 4,2 |
73,2 ± 4,5 < 0,01 |
35,6 ± 2,7 < 0,05 |
23,3 ± 3,3 < 0,001 |
|
ПЭМ 6, % |
M ± m Р |
83,3 ± 1,1 |
93,1 ± 1.4 < 0,001 |
66,2 ± 2,3 < 0,001 |
56,1 ± 2,1 < 0,001 |
|
ПЭМ 7, % |
M ± m |
100,0 ± 0,0 |
100,0 ± 0,0 |
100,0 ± 0,0 |
100,0 ± 0,0 |
Примечание: р – достоверность 2-й группы по сравнению с первой.
В проведенном исследовании на 60 сутки интоксикации ДХЭ, количество общих фосфолипидов снизилось незначительно, в то же время наблюдались изменения в распределении фракций фосфолипидов. Разделение смеси фосфолипидов эритроцитов крыс экспериментальных групп показало наличие пяти компонентов: фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилэтаноламина (ФЭ), фосфатидилсерина (ФС), сфингомиелина (СМ), лизофосфатидилхолина (ЛФХ). При изучении фосфолипидного спектра эритроцитарных мембран у крыс опытной группы наблюдалось перераспределение состава ФЛ в сторону накопления ЛФХ, СМ, ФС и снижения доли ФХ и ФЭ. Анализ фосфолипидного состава выявил снижение содержания легкоокисляемой фракции фосфатидилхолина (ФХ) на 10,4 % (р > 0,05) с одновременным ростом образования ЛФХ на 21,2 % (р < 0,05), который является специфическим маркером фосфолипазной активности. Недостаток ФХ в наружном слое мембран эритроцитов компенсировался за счет повышения количества СМ. В силу высокой насыщенности сфингомиелина в кластеры, которые образует этот фосфолипид в мембране, встраивается большое количество холестерина, что влечет за собой уменьшение проницаемости клеточной мембраны, нарушение процессов активного транспорта, переноса веществ [10]. При интоксикации ДХЭ коэффициент ФХ/СМ, характеризующий уровень перераспределения фосфолипидных фракций внутри мембранного бислоя, составил 2,17 условных единиц. Снижение этого коэффициента на 38,2 % (р < 0,001) в сравнении с группой здоровых животных свидетельствует об уменьшении жидкостных свойств и увеличении микровязкости липидного бислоя.
Фосфолипидные фракции ФЭ и ФС характеризуют внутренний монослой мембраны эритроцитов. Количество ФЭ уменьшилось на 14,3 % (р < 0,05), а содержание ФС возросло на 27,3 % (р < 0,01). Расчет коэффициента ФЭ/ФС показал, что при интоксикации ДХЭ его величина составляет 2,57 усл. ед., что ниже показателей контрольной группы на 32,7 % (р < 0,001). Важным показателем, характеризующим лябильность липидного бислоя, служит коэффициент асимметрии (ФЭ + ФС)/(ФХ + СМ). Отношение суммы фосфолипидов с меньшей насыщенностью жирных кислот, которые располагаются преимущественно во внутреннем монослое липидного бислоя мембран, к фосфолипидам с большей насыщенностью, которые располагаются во внешнем монослое, позволяет получить представления о жидкостности мембраны. При интоксикации ДХЭ значение коэффициента асимметрии ниже контрольной величины на 7,8 % (р < 0,05), что обусловливает повышение насыщенности липидного бислоя и увеличение микровязкости. Выявленная модификация фосфолипидного матрикса клетки свидетельствует о структурно-функциональной несостоятельности цитоплазматической мембраны.
Таблица 2
Содержание основных липидных компонентов в мембранах эритроцитов крыс
при субхронической интоксикации ДХЭ и на фоне применения НИЛИ
|
Исследуемый показатель |
Статистический |
Группы животных |
||
|
1-я группа (n = 11) |
2-я группа (n = 13) |
3-я группа (n = 12) |
||
|
Общие ФЛ мг/100 мл эритроцитарной массы |
M ± m Р* Р** |
287,4 ± 5,1 |
274,5 ± 6,3 > 0,05 |
302,5 ± 7,2 < 0,01 < 0,001 |
|
Общий ХС мг на 100 мл эритроцитарной массы |
M ± m Р* Р** |
142,3 ± 3,4 |
231,3 ± 4,75 < 0,001 |
199,64 ± 6,13 < 0,001 < 0,01 |
|
Коэффициент ХС/ФЛ, усл. ед. |
M ± m Р* Р** |
0,49 ± 0,02 |
0,84 ± 0,03 < 0,001 |
0,66 ± 0,02 < 0,001 < 0,001 |
|
Фракции ФЛ, % |
||||
|
ЛФХ |
M ± m Р* Р** |
4,7 ± 0,25 |
5,7 ± 0,32 < 0,05 |
5,2 ± 0,3 > 0,05 > 0,05 |
|
ФХ |
M ± m Р* Р** |
45,3 ± 1,4 |
40,6 ± 1,9 > 0,05 |
47,8 ± 2,1 > 0,05 < 0,01 |
|
ФЭ |
M ± m Р* Р** |
29,4 ± 1,2 |
25,2 ± 1,4 < 0,05 |
28,7 ± 1,5 > 0,05 > 0,05 |
|
СМ |
M ± m Р* Р** |
12,9 ± 0,7 |
18,7 ± 1,1 < 0,01 |
10,1 ± 0,8 < 0,05 < 0,001 |
|
ФС |
M ± m Р* Р** |
7,7 ± 0,3 |
9,8 ± 0,55 < 0,01 |
8,2 ± 0,4 > 0,05 < 0,05 |
|
Коэффициент ФХ/СМ, усл.ед. |
M ± m Р* Р** |
3,51 ± 0,06 |
2,17 ± 0,07 < 0,001 |
4,73 ± 0,1 < 0,001 < 0,001 |
|
Коэффициент ФЭ/ФС, усл. ед. |
M ± m Р* Р** |
3,82 ± 0,05 |
2,57 ± 0,09 < 0,001 |
3,5 ± 0,08 < 0,01 < 0,001 |
|
Коэффициент (ФЭ+ФС)/(ФХ+СМ), усл.ед. |
M ± m Р* Р** |
0,64 ± 0,01 |
0,59 ± 0.02 < 0,05 |
0,64 ± 0,02 > 0,05 > 0,05 |
Примечание:
р* – достоверность по сравнению с первой группой;
р** – достоверность 3-й группы по сравнению со 2-й.
Таким образом, полученные нами данные позволяют считать, что клеточные мембраны при субхронической интоксикации ДХЭ претерпевают изменения. В результате структурных нарушений мембран клеток могут изменяться их функциональные свойства, что, в конечном счете, может привести к значительным метаболическим расстройствам. Выявленные нарушения клеточных мембран являются важным звеном в патогенезе токсического действия ДХЭ.
В основе клинического эффекта НИЛИ лежит ее способность стимулировать разнообразные процессы защиты, адаптации, компенсации и репарации, т.е. механизмы саногенеза. Электромагнитная природа НИЛИ предполагает возможность его взаимодействия с множеством регуляторных механизмов в живых системах, в том числе с механизмами регуляции мембранной проницаемости. Лазерное облучение, изменяя свойства билипидного слоя, оказывает действие на ионные каналы клеточной
мембраны [7].
Результаты исследования, представленные на рисунке, демонстрируют достоверное увеличение проницаемости мембран эритроцитов в IV, V и VI разведениях мочевины у животных, получавших в качестве коррекции НИЛИ, по сравнению с животными 2-й группы. Улучшение проницаемости мембран под действием лазерного излучения связано с изменениями в их липидном составе, которые характеризуются уменьшением содержания общего холестерина в мембранах, при этом содержание общих фосфолипидов возрастает. Показатель коэффициента ХС/ФЛ, во многом определяющий структуру и функцию мембран, приближается к контрольным значениям. Значения коэффициентов, характеризующих уровень распределения фосфолипидных фракций внутри мембранного бислоя, после проведения курса НИЛИ свидетельствуют о понижении насыщенности липидного бислоя и уменьшении микровязкости.
Сравнение величин ПЭМ у крыс на 60 сутки интоксикации ДХЭ
Таким образом, НИЛИ оказывает упорядочивающее воздействие на жидкокристаллическую структуру липидного бислоя, нормализуя проницаемость эритроцитарной мембраны. В этой связи следует отметить, что, воздействуя низкоинтенсивным лазерным излучением, мы не вносим в организм ничего чужеродного, а лишь корректируем систему саморегулирования и поддержания гомеостаза. Действие НИЛИ на процессы, происходящие в организме, может не проявляться на фоне оптимального функционирования физиологической или биохимической системы, но может быть выражено при сдвигах функционального состояния этих систем.
Выводы
1. При субхронической интоксикации ДХЭ в мембранах эритроцитов нарушается соотношение холестерин/фосфолипиды, наблюдаются изменения в распределении фракций фосфолипидов, что обусловливает повышение насыщенности липидного бислоя и увеличение микровязкости, вызывая понижение их проницаемости. Выявленные нарушения клеточных мембран являются важным звеном в патогенезе токсического действия ДХЭ.
2. Использование курса лазеротерапии понижает насыщенность липидного бислоя и уменьшает микровязкость, нормализуя проницаемость мембран эритроцитов. Данные эксперимента дают основание считать, что использование при интоксикации ДХЭ НИЛИ патогенетически обосновано.