В структуре онкологических заболеваний населения России рак мочевого пузыря (РМП) занимает 8-е место среди мужчин и 18-е - среди женщин. Около 80 % пациентов относятся к возрастной группе 50–80 лет, а пик заболеваемости приходится на 7-е десятилетие жизни. Ежегодно в России регистрируется 11267 больных с впервые выявленным диагнозом РМП [4]. Уровень смертности от этого заболевания во многих индустриально развитых странах составляет от 3 до 8,5 % [5].
Цистоскопия и цитологическое исследование остаются стандартными рутинными диагностическими инструментами для обнаружения и контроля РМП.
Генетические нарушения появляются уже на начальных стадиях развития опухоли и являются основными определяющими факторами малигнизации. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) является цитогенетической технологией, которая используется для анализа хромосомных нарушений в исследуемых клетках. FISH использует флуоресцентные метки в исследовании ДНК, которые крепятся к центромерам хромосом или уникальным участкам, для обнаружения клетки с числовыми, структурными нарушениями, показательными для злокачественного развития [3]. В настоящее время становится широко популярна FISH-методика с высокой чувствительностью и специфичностью для обнаружения РМП, использующая четыре флуоресцентные метки, выявляющие цитогенетические транслокации в хромосомах 17, 3 и 7 и локус-специфический ген 9р21 – ген из семейства опухолевых супрессоров, в 9-й хромосоме [1, 2].
Материалы и методы исследования
Проведено обследование 103 человек, проходящих диспансерное наблюдение по поводу поверхностного рака мочевого пузыря, после ТУР. Обследуемые лица по результатам наблюдения в течение 24 месяцев после ТУР мочевого пузыря были разделены на 3 группы: 1 – пациенты в возрасте от 35 до 59 лет (средний возраст), 31 человек; 2 – 60–74 года (пожилой возраст), 37 человек; 3 – 75–86 лет (старческий возраст), 35 человек. Всем пациентам в течение 24 месяцев после ТУР мочевого пузыря каждые 3 месяца было проведено однотипное обследование, включающее цистоскопию с последующей гистологией и FISH-методикой.
Методика FISH осуществлялась на реагентах компании ABBOTT (США). Набор UroVysion™ Multi-color FISH Probe Mixture включал флуоресцентные ДНК-зонды для определения анеуплоидии хромосом 3, 7 и 17 и утраты локуса 9p21 в образцах мочи больных раком мочевого пузыря (CEP 3 SpectrumRed™, CEP 7 SpectrumGreen, CEP 17 SpectrumAqua, LSI 9p21 (p16) SpectrumGold™). Образцы мочи подготавливались к исследованию согласно протоколу методики. Результат считался FISH-положительным, если в 4 из 25 аномальных клеток обнаруживалось увеличение количества сигналов по 2-м и более хромосомам (3, 7 или 17) в одной и той же клетке, или если более чем в 12 из 25 аномальных клетках отсутствует сигнал 9р21. Если это условие не соблюдалось, то препарат анализировали до тех пор, пока не было обнаружены: 4-клетки с увеличенным количеством сигналов по 3,7 и 17 хромосомам или 12 клеток с отсутствием сигнала 9р21.
Результаты исследования и их обсуждение
Учитывая тот факт, что клинико-морфологические факторы не позволяют полноценно прогнозировать развитие рецидива рака мочевого пузыря, а количество поздних выявлений остается высоким, в том числе у лиц пожилого и старческого возраста, мы провели анализ молекулярно-цитогенетических маркеров данной опухоли с использованием флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) параллельно с цистоскопией и гистологическим исследованием.
Из 103 пациентов в течение 24 месяцев по данным гистологического исследования у 49 (47,6 %) человек развился рецидив заболевания. Из 103 пациентов в течение 24 месяцев, по данным FISH-методики у 51 (49,5 %) человека развился рецидив заболевания, однако в четырех случаях FISH-методика дала неверные ответы: 3 ложноположительных и 1 ложноотрицательный результаты, тем самым показав чувствительность методики – 94,2 %, специфичность – 98,2 % и точность – 96,3 %. В таблице приведены условные обозначения параметров расчета сравнительных характеристик (p < 0,05).
В результате сравнения уровня чувствительности, специфичности и точности методики в зависимости от стадии и дифференцировки опухоли выявлены значимые различия, результаты которых представлены в табл. 1 (p = 0,03).
Таблица 1
Зависимость чувствительности, специфичности и точности FISH-методики
от стадии заболевания и степени дифференцировки опухоли
|
Стадия заболевания и степень |
Сравнительные характеристики |
||
|
чувствительность, % |
специфичность, % |
точность, % |
|
|
рТаG1 |
85,7 |
94,7 |
88,2 |
|
рТаG2 |
88,6 |
95,8 |
92,1 |
|
рТаG3 |
90,7 |
96,2 |
93,8 |
|
рТis G1 |
93,8 |
98,3 |
96,5 |
|
рТis G2 |
94,3 |
98,7 |
98,7 |
|
рТis G3 |
96,5 |
100 |
98,4 |
|
pT1G1 |
98,4 |
100 |
99,2 |
|
pT1G2 |
99,4 |
100 |
99,5 |
|
pT1G3 |
100 |
100 |
100 |
Необходимо отметить, что уже на самых начальных стадиях и при самой высокой степени дифференцировки опухоли FISH-методика показала не менее положительные результаты, так у больных на стадии рТаG1: чувствительность метода составила 85,7 %, специфичность – 94,7 % и точность – 88,2 %.
Полисомию пар 3, 7 и 17 хромосом определяли у всех из 51 больного, у которых FISH-методика дала положительный результат на рецидив рака мочевого пузыря, включенных в исследование, делецию локуса 9р21 – у 37(72,5 %) пациентов.
В зависимости от частоты встречаемости аномальных клеток мы выделили
4 группы:
1) 1–4 % клеток;
2) 5–30 %;
3) 31–60 %;
4) 61–100 %.
Частота выявленных нами хромосомных аномалий представлена в табл. 2.
У большой части пациентов аномалии по 3, 7, 17 и 9 хромосомам встречалась более чем в 60 % клеток. Так, 61–100 % клеток с гиперплоидией по 3 хромосоме выявлены у 22 (47,8 %) человек, по 7 хромосоме у 17 (43,6 %) и по 17 хромосоме ? у 19 (45,2 %) человек, а с делецией локуса 9р21 ? у 15 (40,5 %).
При сравнении возрастных групп определяется большее количество пациентов с числом аномальных клеток 61–100 % в третьей группе – (75–86 лет, n = 35) более чем в 45 % случаев, в то время как в первой (35–59 лет, n = 31) и во второй (60–74 лет, n = 37) группах ? до 35 %. Распределение пациентов с числом аномальных клеток 61–100 % по возрастным группам представлены в табл. 3.
Таблица 2
Частота встречаемости хромосомных аберраций по группам
|
Вид хромосомной аберрации |
Количество клеток в препарате с хромосомными аберрациями |
|||||
|
1–4 % |
5–30 % |
31–60 % |
61–100 % |
Всего |
||
|
абс. |
% |
|||||
|
Гиперплоидия 3 хромосомы |
5/10,9 |
12/26,1 |
7/15,2 |
22/47,8 |
46 |
90,2 |
|
Гиперплоидия 7 хромосомы |
4/10,2 |
9/23,1 |
9/23,1 |
17/43,6 |
39 |
76,5 |
|
Гиперплоидия 17 хромосомы |
4/9,6 |
13/30,9 |
6/14,3 |
19/45,2 |
42 |
82,4 |
|
Делеция локуса 9р21 |
6/16,2 |
6/16,2 |
10/27,3 |
15/40,5 |
37 |
72,5 |
Таблица 3
Распределение пациентов с числом аномальных клеток 61?100 % по возрастным группам
|
Стадия |
Группа 1. 35–59 лет, n = 31 |
Группа 2. 60–74 лет, n = 37 |
Группа 3. 75–86 лет, n = 35 |
Всего |
|
Гиперплоидия 3 хромосомы |
5 (22,7 %) |
7 (31,8 %) |
10 (45,5 %) |
22 |
|
Гиперплоидия 7 хромосомы |
4 (23,5 %) |
5 (29,4 %) |
8 (47,1) |
17 |
|
Гиперплоидия 17 хромосомы |
5 (26,3 %) |
5 (26,3 %) |
9 (47,4 %) |
19 |
С учетом делеции 9р21 частота FISH-положительных результатов оказалась достоверно (р = 0,04) выше по сравнению FISH-положительными результатами только по гиперплоидии 3, 7 и 17 хромосом – 51 и 46 случаев соответственно, что составило разницу почти в 10 %. Количество FISH-положительных результатов c учетом делеции 9р21 и без нее представлено
на рис. 1.
Рис. 1. Количество FISH-положительных результатов c учетом делеции 9р21 и без нее
При анализе дополнительных параметров FISH-диагностики в настоящей работе выявлен рост частоты (среднего числа клеток с хромосомными аномалиями) и глубины (среднего числа копий хромосом 3, 7 и 17 и локуса 9р21) генетических аномалий с увеличением стадии и степени дифференцировки опухоли. Обращает на себя внимание ступенчатое увеличение частоты аномалий при переходе от степени дифференцировки опухоли G1, G2 к степени G3. Результаты этих наблюдений представлены на рис. 2.
Необходимо обратить внимание на то, что наличие ложноположительных результатов при использовании метода флуоресцентной in situ гибридизации не всегда является таковым. Неоднократно было замечено в ходе исследования, что у пациентов, у которых на ранних сроках после трансуретральной резекции мочевого пузыря методика FISH давала положительный результат наряду с отрицательными данными цистоскопии и гистологического исследования, спустя месяц или два выявлялся рецидив заболевания, подтвержденный морфологическими исследованиями.
Рис. 2. Распределение частоты (среднего числа клеток с хромосомными аномалиями) и глубины (среднего числа копий хромосом 3, 7 и 17 и локуса 9р21) генетических аномалий с увеличением стадии и степени дифференцировки опухоли, %
Заключение
Внедрение молекулярно-цитогенетических методов в урологическую практику будет способствовать ранней диагностике рака мочевого пузыря, окажет существенную помощь при мониторинге заболевания, значительно повысит эффективность выявления рецидивов РМП, особенно у лиц пожилого возраста. Использование молекулярно-цитогенетических маркеров позволяет расширить общепринятую систему клинико-морфологических маркеров прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря.