В современной кардиохирургии широкое применение получило использование гипотермии, как наиболее доступного способа интраоперационной защиты ишемизированного миокарда. Однако данная технология является далеко не идеальной. Энергетический метаболизм после возобновления кровообращения и выхода из состояния искусственной гибернации не успевает восстановиться в полном объеме. Тем самым провоцируется энергетический сдвиг, перенасыщение миокардиоцитов ионами кальция, что в конечном итоге приводит к функциональной несостоятельности миокарда [7, 9, 10, 11, 12]. Также остается открытым вопрос о неконтролируемом выходе сердца из состояния гипотермии через фибрилляцию желудочков [12, 132, 4, 6, 10, 16]. Таким образом, является актуальным поиск новых способов интраоперационной защиты миокарда как через фармакологичекое воздействие, так и в комплексе с другими методами. Перспективным способом снижения ишемических и реперфузионных повреждений является использование фармакологических препаратов, обеспечивающих восстановление энергетического пула клеток, дезактивация процессов липопероксидации и сохранность эндотелия сосудов [3, 5, 8, 13, 16]. В качестве таких препаратов могут быть использованы экзогенные макроэргические фосфаты и антиоксиданты [5, 13]. Однако эти вещества в свободной форме слабо проникают через клеточную мембрану. Решением данной проблемы может стать использование липосом, как контейнеров для адресной доставки лекарственного средства внутрь кардиомиоцитов, что обеспечивает значительное снижение действующих концентраций [2, 5]. Для целей фармакологической ишемической кардиопротекции важнейшим свойством липосом является их способность накапливаться в зоне инфаркта и осуществлять транспорт внутрь клеток [2, 5, 14, 15].
В данном исследовании была проведена оценка функциональной состоятельности миокарда после гипотермической ишемии и последующей реперфузии и возможности коррекции ишемических повреждений липосомальными препаратами антиоксидантов и макроэргических фосфатов.
Материалы и методы исследования
Эксперименты проводились на 40 крысах самцах субпопуляции Вистар с массой тела 250-300 г. Под тиопенталовым наркозом животным быстро вскрывали грудную клетку, извлекали сердце и фиксировали его на аортальной канюле перфузионной системы. Перфузионная среда представляла собой раствор Кребса-Хензеляйта, оксигенированный смесью 95 % О2 и 5 % СО2 (рО2 = 450?550 мм рт. ст., рН = 7,4). После 15-минутной адаптирующей коронарной перфузии по методу Langendorff переходили на 15-минутную антеградную левопредсердную перфузию по Nilley в нормальном гемодинамическом режиме. При антеградной перфузии с 10 по 15 минуте из общего объема оттекающего перфузата отбирали аликвоту для определения активности лактатдегидрогеназы.
На 15 минуте антеградной перфузии измеряли величину коронарного протока и аортального выброса при сопротивлении перфузата 80 мм водного столба. После чего все исследуемые сердца были подвергнуты 60-минутной ишемии при температуре 14 °С. Во время тотальной ишемии через аортальную канюлю сердца проводили гипоперфузию со скоростью 0,1 мл/мин раствором аденозинтрифосфата и креатинфосфата (2 %АТФ + 2 %КФ) или липосомальными препаратами антиоксидантов (супероксиддисмутаза, каталаза, альфа-токоферол (ЛП-АО)) или макроэргических фосфатов (ЛП-МЭФ). Липосомальные композиции получали по методике, описанной ранее [3], с использованием экструдера (Lipex Biomembranes, Canada). Размер пор мембран поликарбонатного фильтра составлял 50 нм, количество циклов экструзии ? 20. Состав внутренней водной и липидной фаз липосом показан в таблице. Не включившиеся в липосомы препараты удаляли методом гель-фильтрации через колонку с Sepharose 4B.
Состав липосомальных композиций, использованных в эксперименте
|
Вид липосом |
Липидная фаза |
Внутренняя фаза |
|
|
Состав |
Молярное соотношение |
||
|
ЛП-МЭФ |
ФХ:Х |
7:5 |
0,9 %NaCl + 2 %КФ + 2 %АТФ |
|
ЛП-АО |
ФХ:Х:αТФ |
7:5:0,5 |
0,9 % NaCl + 2 мг/мл СОД + 2 мМ ГТ |
Примечания:
ФХ - яичный фосфатидилхолин; Х - холестерин; КФ - креатинфосфат; αТФ - α-токоферол; СОД - супероксиддисмутаза; ГТ - восстановленный глутатион. ПЛ - «пустые» липосомы; ЭЛ - «энергетические» липосомы; АЛ - «антиоксидантные» липосомы.
Контрольной группой служили сердца, в которые вместо препаратов вводили физиологический раствор. Скорость гипоперфузии во время ишеми во всех группах составляла 0,1 мл/мин при концентрации липидов в липосомальных композициях 10 мг/мл. После этого сердца реперфузировали 15 мин по Langendorff, регистрируя каждые 5 мин показатели коронарного потока. Из общего объема оттекающего от сердца перфузата отбирали аликвоту для определения активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (DiaSys, Германия). Затем переходили на 15 мин антеградную перфузию по Neelley для изучения минутного объема.
Статистический анализ
Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0. В качестве критерия сравнения выбирали дисперсионный анализ (ANOVA). Различия считали достоверными при уровне значимости менее 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования насосной функции изолированного сердца в до- и постишемическом периоде позволили выявить следующие закономерности. Исходный минутный объем сердца был одинаковым во всех четырех группах и составил 53-60 мл/мин (рис. 1). Однако постишемическая реперфузия демонстрировала существенные различия между исследованными группами. Так, насосная функция полностью отсутствовала у сердец контрольной группы. При реперфузии по Langendorf коронарный проток у этих сердец крыс был сохранен, хотя и снижен на 30 % по сравнению с другими группами. Однако при переводе на антеградную перфузию сократимость миокарда была недостаточной для преодоления периферического сопротивления и насосная функция отсутствовала. При этом необходимо учитывать, что ишемический режим, избранный в данном эксперименте, не был слишком жестким - гипотермия при 14 °С является оптимальной для сохранения структурной и функциональной активности миокарда [1, 8]. С другой стороны, оптимальное сохранение функции наблюдали в сердцах, защищаемых в ишемическом периоде липосомами, содержащими в мембранной фазе α-токоферол, а в водной - супероксиддисмутазу и восстановленный глутатион. Эти сердца при переходе на антеградную реперфузию по Neelley восстанавливали показатели МОС на 70 % от исходных значений и сохраняли стабильные значения на протяжении всего периода реперфузии.
В сердцах, защищаемых во время ишемии свободными макроэргическими фосфатами, а также их липосомальной формой, наблюдали восстановление насосной функции на 48 и 31 % соответственно. Однако эти показатели имели в дальнейшем тенденцию к снижению и к 15-й минуте реперфузии по Neelley составили 33 и 20 % от исходного соответственно. Необходимо отметить, что сердца, защищаемые липосомальной формой АТФ и КФ, демонстрировали достоверно (р < 0,05) худшую насосную функцию, чем при использовании свободной формы макроэргических фосфатов.
Рис. 1. Изменение минутного объема сердца в реперфузионном периоде после 60-минутной тотальной ишемии при 14 °С. В течение ишемии проводилась гипоперфузия исследуемыми препаратами. Скорость гипоперфузии 0,1 мл/мин.
Условные обозначения: контроль - гипоперфузия 0,9 % раствором NaCl, АТФ + КФ гипоперфузия раствором, содеражащим 2 % АТФ и 2 % КФ, ЛП-МЭФ - гипоперфузия липосомальной композицией, содержащей внутри липосом 2 % АТФ и 2 % КФ, ЛП-АО - гипоперфузия липосомальной композицией, содержащей в составе липосом антиоксиданты - α-токоферол, супероксиддисмутазу и восстановленный глутатион
Этот феномен в значительной мере согласуется с данными, полученными при изучении активности ЛДГ в перфузате.
В контрольной группе без применения защиты на 5-й минуте реперфузии по Langendorff активность данного фермента в перфузате была в 3 раза выше исходной (р < 0,01), а к 15-й минуте - в 6 раз выше (р < 0,01) (рис. 2). Повышение активности фермента в перфузате обусловлено его выходом из клеток и указывает на значительные повреждения мембран кардиомиоцитов.
Минимальный выход ЛДГ наблюдали в группе с антиишемичекой защитой антиоксидантными липосомами: до 10-й минуты реперфузии активность фермента достоверно (р > 0,05) не отличалась от исходной, и лишь к 15-й минуте появилась тенденция к повышению активности.
В группах, защищаемых от ишемии свободной и липосомальной формами макроэргическими фосфатами, выход ЛДГ высок уже на 5-й минуте ретроградной реперфузии, хотя и достоверно (р < 0,05) ниже, чем в контрольной группе. В дальнейшем активность фермента имеет тенденцию к повышению, причем показатели выше в группе, где использовали свободную форму макроэргических фосфатов.
Так как ЛДГ в норме является внутриклеточным ферментом и отсутствует во внеклеточных жидкостях, данные результаты можно интерпретировать следующим образом. Максимальное клеточное повреждение проявляется в контрольной точке сразу же по окончании периода ишемии. Последующая реперфузия, как известно, усиливает отрицательные эффекты ишемии за счет свободного кислорода, поступающего в миокард при реоксигенации и не утилизируемого миокардиоцитами в связи с глубоким нарушением метаболических циклов. Соответственно, возрастает и выход внутриклеточного фермента во внеклеточное пространство.
Рис. 2. Динамика активности ЛДГ в реперфузионном периоде после 60-минутной тотальной ишемии при 14 °С. В течение ишемии проводилась гипоперфузия исследуемыми препаратами. Скорость гипоперфузии 0,1 мл/мин.
Условные обозначения: контроль - гипоперфузия 0,9 % раствором NaCl, АТФ + КФ гипоперфузия раствором, содеражащим 2 % АТФ и 2 % КФ, ЛП-МЭФ - гипоперфузия липосомальной композицией, содержащей внутри липосом 2 % АТФ и 2 % КФ, ЛП-АО - гипоперфузия липосомальной композицией, содержащей в составе липосом антиоксиданты - α-токоферол, супероксиддисмутазу и восстановленный глутатион
Минимальное клеточное повреждение, и, соответственно, лучшую сохранность насосной функции при ишемии и реперфузии обнаруживают сердца, защищаемые антиоксидантными липосомами.
Меньшее повреждение мембранных структур клетки, но при этом худшая функция выявлены в группе сердец крыс, защищаемых липосомами с макроэргическими фосфатами (в сравнении со свободной формой ATP и КФ). По-видимому, это связано с прямым липосомальным транспортом АТФ в клетку и быстрым включением ее в катаболические процессы при достаточной сохранности мембран. Вероятно, что мембрана кардиомиоцитов, поврежденная во время ишемии, становится проницаемой для свободной формы ATP и КФ, в связи с чем в этой группе наблюдали лучшее восстановление насосной функции, по сравнению с группой ЛП-МЭФ.
Выводы
Липосомальные препараты могут быть эффективно использованы для интраоперационной защиты изолированного сердца в условиях гипотермии. Свободные и липосомальные формы макроэргических фосфатов не оказывают ожидаемый защитный эффект. Напротив, при интракоронарном введении наиболее выраженное протективное действие оказывает липосомальная форма комплекса антиоксидантов, что проявляется в сохранности минутного объема и достоверно более низком значении активности ЛДГ в оттекающем от сердца перфузате.