Долгое время исследователи безуспешно пытались определить возможную корреляцию вариаций генома в виде гетероморфизма гетерохроматиновых районов хромосом, так называемыми хромосомными или С-вариантами, у супружеских пар с нарушениями репродуктивной функции (НРФ) [6, 7, 1-5, 10, 13]. Актуальна по-прежнему проблема генетического консультирования при выявлении хромосомных вариантов у супружеских пар с НРФ, поскольку до сих пор роль вариаций гетерохроматина в норме и при патологии до настоящего времени не определена [3]. Как известно, хромосомные варианты представляют собой экстремальное увеличение или уменьшение размеров гетерохроматиновых участков хромосом, инверсии этих участков (частичные или полные), а также двойные или увеличенные спутники или спутничные нити хромосом [3, 7]. Ряд исследователей отмечают экстремальные хромосомные варианты у супружеских пар c бесплодием, со спонтанными абортами (два и более), в группе супружеских пар с мертворождением или рождением ребёнка с врождёнными пороками развития, с синдромом Дауна и другой хромосомной патологией, детей с аутизмом [1-4, 11, 13]. Для изучения экстремальных вариантов хромосом необходимо использовать различные цитогенетические (в основном, метод С-окрашивания) и молекулярно-цитогенетические методы - FISH, а также метод количественной гибридизации in situ - QFISH [3,12]. В последнее время уменьшается число исследований по цитогенетическому изучению вариаций гетерохроматина у супружеских пар с НРФ. А между тем, врачи-генетики по-прежнему испытывают трудности при медико-генетическом консультировании супружеских пар с НРФ и обнаруженными у них хромосомными вариантами. Клинические цитогенетики, как правило, не придают большого значения С-вариантам и в основном не используют в своей работе метод С-окрашивания, т.е. хромосомные варианты даже не регистрируются во многих лабораториях, несмотря на то, что описано много клинических случаев изменения гетерохроматиновых районов хромосом, затрагивающих и эухроматин, в результате которого наблюдаются негативные события в семье. Нашими лабораториями описаны два неродственных случая перицентрической инверсии околоцентромерного гетерохроматина хромосомы 7, затрагивающей и эухроматиновые районы, которая была причиной характерных фенотипических нарушений: умственной отсталости, задержки развития, эктродактилии, микроаномалий лица. На основании молекулярно-цитогенетических исследований семьи мы сделали вывод о том, что речь идёт о новом хромосомном синдроме. Высказано предположение о том, что это связано с эффектом положения генов у человека [3].
Целью настоящей работы явилось цитогенетическое и молекулярно-цитогенетическое изучение вариаций гетерохроматиновых районов хромосом у супружеских пар с НРФ, а также выявление возможной связи их гетероморфизма с НРФ для повышения эффективности медико-генетического консультирования.
Материал и методы исследования
Материалом исследования служили культивируемые лимфоциты периферической крови 1264 индивидуумов из 632 супружеских пар с бесплодием, спонтанными абортами (два и более), мертворождением или наличием у ребёнка умственной отсталости с врождёнными пороками развития, недифференцированной умственной отсталостью, синдромом Дауна и другой хромосомной патологией. Супружеским парам проводили цитогенетическое исследование по следующим показаниям:
-
наличие в семье ребёнка с задержкой психомоторного (ЗПМР) или психоречевого (ЗПРР) или физического развития (ЗФР), врождёнными пороками развития (ВПР) и/или микроаномалиями развития (МАР);
-
наличие у ребёнка хромосомной патологии (регулярные или мозаичные трисомии или моносомии, дупликации, делеции, инверсии, инсерции, транслокации, маркерные хромосомы), включая синдром Дауна;
-
спонтанные аборты (два и более);
-
бесплодие неясной этиологии.
Хромосомы идентифицировали с помощью дифференциального окрашивания по длине, используя GTG и CBG методы. Анализировали от 20 до 100 метафазных пластинок в зависимости от индивидуальных показаний к исследованию при увеличении ×1125. Приготовление хромосомных препаратов проводили стандартным общепринятым методом с нашими модификациями [3]. При С-окрашивании хромосом размер С-гетерохроматина учитывался, согласно ранее представленному анализу [6]. Молекулярно-цитогенетические исследования (FISH) проводили с помощью ранее описанных методов [3, 14] с использованием оригинальных ДНК зондов из коллекции лаборатории цитогенетики и геномики психических заболеваний Научного Центра психического здоровья РАМН, специфичных для центромерных или прицентромерных участков хромосом [8, 9, 14, 15]. Количественный анализ QFISH проводили согласно оригинальному протоколу [12].
Результаты исследования и их обсуждение
Цитогенетическое исследование культивируемых лимфоцитов периферической крови проводили 632 супружеским парам (1264 индивидуумам) с целью исключения хромосомной патологии, а также для анализа вариаций гетерохроматиновых районов хромосом и возможной корреляции с НРФ. Супружеские пары, учитывая показания, были разделены на 6 групп, представленных в табл. 1.
Следует отметить, что супружеские пары, которые, имели сочетанные нарушения в анамнезе и супружеские пары с синдромом Дауна у ребёнка, были выделены в отдельные группы (табл. 2. группа 3 и 6). В табл. 2 представлен удельный вес хромосомных вариантов у супружеских пар с НРФ. Определяя удельный вес хромосомных вариантов в каждой группе супружеских пар с НРФ в отдельности, обнаружили высокий удельный вес в группе супружеских пар с бесплодием 48,4%, в то время как у супружеских пар с наличием хромосомной аномалии у ребёнка - 25,6%. Следует отметить, что частота хромосомных вариантов значительно не отличалась в группах супружеских пар с хромосомными аномалиями и с синдромом Дауна у ребёнка - 25,6 и 27,7%, соответственно.
Таблица 1 Удельный вес хромосомных вариантов в различных по обращению группах у супружеских пар с НРФ
Группы |
Супружеские пары n = 632 |
Причины обращений |
Число обследованных индивидуумов |
Удельный вес хромосомных вариантов в каждой группе |
|
Всего (n = 1264) |
С хромосомными вариантами (n = 472) |
||||
1 |
63 |
Бесплодие |
126 |
61 |
48,4 |
2 |
130 |
Спонтанные аборты (два и более) |
260 |
106 |
40,8 |
3 |
39 |
Сочетанные обращения: спонтанные аборты и наличие в семье ребёнка с ЗППР, ЗПМР, ЗФР, ВПР, МАР |
78 |
35 |
44,9 |
4 |
182 |
Наличие в семье ребёнка с ЗППР, ЗПМР, ЗФР, ВПР, МАР |
364 |
154 |
42,3 |
5 |
115 |
Наличие у ребёнка хромосомной аномалии, исключая синдром Дауна |
230 |
59 |
25,6 |
6 |
103 |
Наличие в семье ребёнка с синдромом Дауна |
206 |
57 |
27,7 |
Таблица 2 Обнаруженные хромосомные варианты и их удельный вес по отдельным хромосомам и группам хромосом
Группы хромосом |
Хромосомы |
Обнаруженные хромосомные варианты |
Общее число хромосомных вариантов (удельный вес) |
|
по отдельным хромосомам |
по группам хромосом |
|||
A |
1 |
1qh-; 1qh+; 1phqh; 1phqhqh- |
176 (23,2) |
176 (23,2) |
C |
6 |
6ph+ |
1 (0,1) |
278 (36,7) |
9 |
9qh-; 9qh+; 9ph; 9phqh; 9phqhqh+ |
276 (36,4) |
||
12 |
12cenh+ |
1 (0,1) |
||
D |
13 |
13pss; 13ps+; 13pstk+; 13cenh-; 13cenh+, 13phqh |
19 (2,5) |
102 (13,4) |
14 |
14pss; 14ps+; 14pstk+; 14cenh-; 14cenh+, 14phqh |
22 (2,9) |
||
15 |
15pss; 15ps+; 15pstk+; 15cenh-; 15cenh+; 15phqh; 15phqhcenh+ |
61 (8,1) |
||
E |
16 |
16qh-; 16qh+ |
77 (10,2) |
91 (12) |
17 |
17ps; 17ph+ |
13 (1,7) |
||
18 |
18ph+ |
1 (0,1) |
||
F |
19 |
19qh+ |
2 (0,3) |
5 (0,7) |
20 |
20ph+; 20qh+ |
3 (0,4) |
||
G |
21 |
21pss; 21ps+; 21pstk+; 21cenh-; 21cenh+ |
34 (4,5) |
106 (14) |
22 |
22pss; 22ps+; 22pstk+; 22cenh-; 22cenh+ |
25 (3,3) |
||
Y |
Yqh-; Yqh+ |
47 (6,2) |
||
ИТОГО |
15 |
50 видов |
758 (100) |
758 (100) |
Хромосомные варианты у супружеских пар с НРФ обнаружены у 472 индивидуумов (37,3%) (рис. 1а). Анализ каждой группы индивидуумов с С-вариантами определил вклад каждой группы в общую частоту. На рис. 1б видно, что хромосомные варианты преобладают в группе индивидуумов из супружеских пар с наличием ребёнка с ЗПМР и/или ЗФР, ВПР и/или МАР (группа 4, табл. 1), а наименьший вклад хромосомных вариантов в общую частоту вносит группа индивидуумов из супружеских пар с сочетанными обращениями (группа 3, табл. 1).
Хромосомные варианты у женщин встречались несколько чаще, чем у мужчин 242 (19,1%) и 230 (18,2%), соответственно. Анализируя наши данные, следует отметить, что в работе регистрировали все типы обнаруженных хромосомных вариантов. Как видно из табл. 2, выявлено 50 различных видов С-вариантов 15 хромосом: 1, 6, 9, 12-22 и Y во всех группах. В настоящем исследовании обнаружены при С-окрашивании редкие варианты хромосом (6ph+, 12cenh+, 18ph+, 19qh+, 20ph+ и 20qh+) (см. табл. 2). Носителями С-вариантов по хромосомам 6, 12 и 18 были женщины из разных групп супружеских пар. У матери ребёнка с ЗПМР и МАР был обнаружен хромосомный вариант 12cenh+. Женщина со спонтанными абортами была носителем редкого С-варианта 18ph+. Такие хромосомные варианты у супружеских пар, как 19qh+, 20ph+, были описаны ранее [3]. Известно, что размеры С-гетерохроматина таких хромосом, как 1, 9, 16, Y и всех акроцентриков, стабильны, сегрегируют в семье и кодоминантно наследуются [7]. Варианты хромосом 6, 12, 18, 19, 20 редки (см. табл. 2) и необходимо накапливать данные с этими С-вариантами у супружеских пар с НРФ для их изучения.
а
б
в
Рис. 1. Частоты и удельный вес различных хромосомных вариантов у супружеских пар с НРФ: а - частота хромосомных вариантов у 632 супружеских пар с НРФ (1264 индивидуума); б - частота С-вариантов у индивидуумов из разных исследуемых групп супружеских пар с НРФ; 4,8% - индивидуумы с бесплодием (группа 1, табл. 2); 8,4% - спонтанные аборты у супруги (группа 2, табл. 2); 2,8% - сочетанные обращения (группа 3, табл. 2); 12,2% - индивидуумы с ЗПМР и/или ЗФР, ВПР и/или МАР у ребёнка (группа 4, табл. 2); 4,6% - индивидуумы с хромосомной аномалией у ребёнка (группа 5, табл. 2); 4,5% индивидуумы с синдромом Дауна у ребёнка (группа 6, табл. 2); индивидуумы без хромосомных вариантов - 62,7%; в - удельный вес С-вариантов по отдельным хромосомам у 632 супружеских пар с НРФ (1264 индивидуума)
При обработке данных по 472 индивидуумам с С-вариантами мы получили в совокупности 758 хромосомных вариантов (см. табл. 2) по разным хромосомам, что в среднем составляет 1,6 на индивидуума. Анализируя все хромосомы с С-вариантами в отдельности, где их учитывали как в изолированном, так и в сочетанном состоянии (когда в кариотипе у индивидуума несколько вариантов), был получен удельный вес и определён вклад отдельной хромосомы в группу хромосом с С-вариантами. Как видно из табл. 2 и на рис. 1в, наиболее часто встречались варианты по хромосомам 9, 1 и 16. Так, 276 из обнаруженных 758 хромосомных вариантов были по хромосоме 9, что составило 36,4%; по хромосоме 1 - 176 (23,2%); по хромосоме 16 - 77 (10,2%), по хромосоме 15 - 61 (8,1%), по хромосоме Y - 47 (6,2%), по хромосоме 21 - 34 (4,5%) и по остальным хромосомам - 87 (11,4%). Таким образом, частыми хромосомами с С-вариантами были хромосомы: 9, 1 и 16. Анализируя С-варианты по каждой из этих хромосом, мы обнаружили, что среди выявленных хромосомных вариантов по хромосомам 1 (1qh-, 1qh+, 1phqh и 1phqhqh-) и 9 (9qh-, 9qh+, 9ph, 9phqh и 9phqhqh+) наиболее часто встречались инверсии 1phqh - 118 (67%) из 176 и 9phqh - 145 (52,5%) из 276, нежели экстремально увеличенные или уменьшенные гетерохроматиновые участки хромосом (С-варианты). Вариация в виде уменьшенного блока гетерохроматина в хромосоме 16 (16qh-) встречалась в 2 раза чаще, чем 16qh+.
При обнаружении экстремальных хромосомных вариантов индивидуумам из супружеских пар проводили количественную флюоресцентную гибридизацию in situ (QFISH) для определения вариаций числа копий ДНК. Этот метод использовали с применением ДНК пробы, специфичной для хромосомы 9 (D9Z4). На рис. 2 представлен пример анализа экстремального С-варианта (увеличения гетерохроматинового участка) хромосомы 9 методом QFISH. При измерении интенсивности двух гибридизационных сигналов пик интенсивности одного одиночного сигнала равнялся 187694 пикселя, а другого - 62229 пикселей. Соотношение интенсивности двух сигналов 3:1 свидетельствует о различии в содержании ДНК гетерохроматиновых участков гомологичных хромосом.
Рис. 2. Использование количественной FISH для определения увеличения гетерохроматинового района хромосомы 9 (9qh+)
Маркирование вариабельного участка гетерохроматина хромосомы 1 с помощью флюоресцентной гибридизации in situ позволило количественно сравнить содержание ДНК в данном участке двух гомологичных хромосом. При молекулярно-цитогенетическом исследовании обнаружили 3-кратное увеличение гетерохроматинового района одного из гомологов за счёт вариаций числа копий последовательностей «классической» сателлитной ДНК. Было показано неспецифическое изменение в гетерохроматиновых районах, содержащих высокоповторяющиеся последовательности, т.е. увеличение числа копий «классической» сателлитной ДНК. Таким образом, вариации (гетероморфизм) гетерохроматина хромосомы 1 связаны с числом последовательностей «классической» сателлитной ДНК.
Молекулярно-цитогенетическое исследование (FISH) применяли также в случаях редко встречающейся перицентрической инверсии с использованием альфоидных центромерных ДНК зондов и сайт-специфичных ДНК зондов для локусов короткого и длинного плеч на хромосому 7 (MCG-P-2.6.Bst; MCG-P-405-01st; alphaR1-5mv). Описание этого исследования подробно изложено ранее [3], где отмечено, что инверсия привела к необычному положению центромерного гетерохроматина (двух блоков альфоидной ДНК) по отношению к эухроматину короткого и длинного плеч хромосомы 7, и, следовательно, изменению порядка расположения генов в соответствующих хромосомных участках. Аналогичная перицентрическая инверсия хромосомы 7 и различные её фенотипические проявления у здорового фенотипически нормального отца и больного ребенка может быть связана с эффектом положения генов. Поскольку непосредственного изменения последовательностей кодирующей ДНК в данном случае не наблюдается, то, вероятно, нарушение связано с изменением последовательности расположения генов в хромосомных участках, расположенных в непосредственной близости с перестроенным конститутивным гетерохроматином. Возможно, в подобных случаях необходимо дальнейшие исследования, такие как сравнительная геномная гибридизация (array CGH), которая позволит сканировать вариации генома на более высоком уровне разрешения и определить возможные изменения последовательности расположения генов в хромосомных участках [3, 10]. Этот случай демонстрирует необходимость изучения хромосомных вариантов и, прежде всего, проводить метод С-окрашивания при цитогенетическом исследовании, а при их обнаружении, по возможности, применять молекулярно-цитогенетические методы.
Заключение. Таким образом, при цитогенетическом исследовании 632 супружеских пар с НРФ хромосомные варианты обнаружили у 472 из 1264 обследованных индивидуумов, т.е. частота хромосомных вариантов составила 37,3%. Цитогенетическое исследование у супружеских пар с НРФ показало в группах: A, C, D, E, F и G 50 различных С-вариантов 15 хромосом: 1, 6, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 и Y, а также редко встречаемые 6ph+, 12cenh+, 17ps и 17ph+, 18ph+, 19qh+, 20ph+. Анализ гетероморфизма околоцентромерных гетерохроматиновых районов отдельных хромосом показал высокий удельный вес по хромосоме 9 - 36,4%; по хромосоме 1 - 23,2%; по хромосоме 16 - 10,2%. Результаты нашего исследования показали высокую частоту вариантов с НРФ у супружеских пар. Из работы можно сделать вывод о том, что необходимо проводить метод С-окрашивания при цитогенетическом исследовании и регистрировать все хромосомные варианты, включая редкие и инверсии околоцентромерного гетерохроматина для их изучения и подтверждения гипотезы об эффекте положения генов. В подобных случаях необходимо использовать сканирование генома с помощью ДНК микроматриц - новейшей технологии (серийной сравнительной геномной гибридизации) с целью определения геномных микроаномалий, что будет использовано в нашей дальнейшей работе [10]. Для определения связи хромосомных вариантов с НРФ у супружеских пар необходимы исследования с использованием новейших выше указанных технологий.
Работа поступила в редакцию 10.09.2012