Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Долгое время исследователи безуспешно пытались определить возможную корреляцию вариаций генома в виде гетероморфизма гетерохроматиновых районов хромосом, так называемыми хромосомными или С-вариантами, у супружеских пар с нарушениями репродуктивной функции (НРФ) [6, 7, 1-5, 10, 13]. Актуальна по-прежнему проблема генетического консультирования при выявлении хромосомных вариантов у супружеских пар с НРФ, поскольку до сих пор роль вариаций гетерохроматина в норме и при патологии до настоящего времени не определена [3]. Как известно, хромосомные варианты представляют собой экстремальное увеличение или уменьшение размеров гетерохроматиновых участков хромосом, инверсии этих участков (частичные или полные), а также двойные или увеличенные спутники или спутничные нити хромосом [3, 7]. Ряд исследователей отмечают экстремальные хромосомные варианты у супружеских пар c бесплодием, со спонтанными абортами (два и более), в группе супружеских пар с мертворождением или рождением ребёнка с врождёнными пороками развития, с синдромом Дауна и другой хромосомной патологией, детей с аутизмом [1-4, 11, 13]. Для изучения экстремальных вариантов хромосом необходимо использовать различные цитогенетические (в основном, метод С-окрашивания) и молекулярно-цитогенетические методы - FISH, а также метод количественной гибридизации in situ - QFISH [3,12]. В последнее время уменьшается число исследований по цитогенетическому изучению вариаций гетерохроматина у супружеских пар с НРФ. А между тем, врачи-генетики по-прежнему испытывают трудности при медико-генетическом консультировании супружеских пар с НРФ и обнаруженными у них хромосомными вариантами. Клинические цитогенетики, как правило, не придают большого значения С-вариантам и в основном не используют в своей работе метод С-окрашивания, т.е. хромосомные варианты даже не регистрируются во многих лабораториях, несмотря на то, что описано много клинических случаев изменения гетерохроматиновых районов хромосом, затрагивающих и эухроматин, в результате которого наблюдаются негативные события в семье. Нашими лабораториями описаны два неродственных случая перицентрической инверсии околоцентромерного гетерохроматина хромосомы 7, затрагивающей и эухроматиновые районы, которая была причиной характерных фенотипических нарушений: умственной отсталости, задержки развития, эктродактилии, микроаномалий лица. На основании молекулярно-цитогенетических исследований семьи мы сделали вывод о том, что речь идёт о новом хромосомном синдроме. Высказано предположение о том, что это связано с эффектом положения генов у человека [3].

Целью настоящей работы явилось цитогенетическое и молекулярно-цитогенетическое изучение вариаций гетерохроматиновых районов хромосом у супружеских пар с НРФ, а также выявление возможной связи их гетероморфизма с НРФ для повышения эффективности медико-генетического консультирования.

Материалом исследования служили культивируемые лимфоциты периферической крови 1264 индивидуумов из 632 супружеских пар с бесплодием, спонтанными абортами (два и более), мертворождением или наличием у ребёнка умственной отсталости с врождёнными пороками развития, недифференцированной умственной отсталостью, синдромом Дауна и другой хромосомной патологией. Супружеским парам проводили цитогенетическое исследование по следующим показаниям:

1. наличие в семье ребёнка с задержкой психомоторного (ЗПМР) или психоречевого (ЗПРР) или физического развития (ЗФР), врождёнными пороками развития (ВПР) и/или микроаномалиями развития (МАР);
2. наличие у ребёнка хромосомной патологии (регулярные или мозаичные трисомии или моносомии, дупликации, делеции, инверсии, инсерции, транслокации, маркерные хромосомы), включая синдром Дауна;
3. спонтанные аборты (два и более);
4. бесплодие неясной этиологии.

Хромосомы идентифицировали с помощью дифференциального окрашивания по длине, используя GTG и CBG методы. Анализировали от 20 до 100 метафазных пластинок в зависимости от индивидуальных показаний к исследованию при увеличении ×1125. Приготовление хромосомных препаратов проводили стандартным общепринятым методом с нашими модификациями [3]. При С-окрашивании хромосом размер С-гетерохроматина учитывался, согласно ранее представленному анализу [6]. Молекулярно-цитогенетические исследования (FISH) проводили с помощью ранее описанных методов [3, 14] с использованием оригинальных ДНК зондов из коллекции лаборатории цитогенетики и геномики психических заболеваний Научного Центра психического здоровья РАМН, специфичных для центромерных или прицентромерных участков хромосом [8, 9, 14, 15]. Количественный анализ QFISH проводили согласно оригинальному протоколу [12].

Цитогенетическое исследование культивируемых лимфоцитов периферической крови проводили 632 супружеским парам (1264 индивидуумам) с целью исключения хромосомной патологии, а также для анализа вариаций гетерохроматиновых районов хромосом и возможной корреляции с НРФ. Супружеские пары, учитывая показания, были разделены на 6 групп, представленных в табл. 1.

Следует отметить, что супружеские пары, которые, имели сочетанные нарушения в анамнезе и супружеские пары с синдромом Дауна у ребёнка, были выделены в отдельные группы (табл. 2. группа 3 и 6). В табл. 2 представлен удельный вес хромосомных вариантов у супружеских пар с НРФ. Определяя удельный вес хромосомных вариантов в каждой группе супружеских пар с НРФ в отдельности, обнаружили высокий удельный вес в группе супружеских пар с бесплодием 48,4%, в то время как у супружеских пар с наличием хромосомной аномалии у ребёнка - 25,6%. Следует отметить, что частота хромосомных вариантов значительно не отличалась в группах супружеских пар с хромосомными аномалиями и с синдромом Дауна у ребёнка - 25,6 и 27,7%, соответственно.

Таблица 2 Обнаруженные хромосомные варианты и их удельный вес по отдельным хромосомам и группам хромосом

Хромосомные варианты у супружеских пар с НРФ обнаружены у 472 индивидуумов (37,3%) (рис. 1а). Анализ каждой группы индивидуумов с С-вариантами определил вклад каждой группы в общую частоту. На рис. 1б видно, что хромосомные варианты преобладают в группе индивидуумов из супружеских пар с наличием ребёнка с ЗПМР и/или ЗФР, ВПР и/или МАР (группа 4, табл. 1), а наименьший вклад хромосомных вариантов в общую частоту вносит группа индивидуумов из супружеских пар с сочетанными обращениями (группа 3, табл. 1).

Хромосомные варианты у женщин встречались несколько чаще, чем у мужчин 242 (19,1%) и 230 (18,2%), соответственно. Анализируя наши данные, следует отметить, что в работе регистрировали все типы обнаруженных хромосомных вариантов. Как видно из табл. 2, выявлено 50 различных видов С-вариантов 15 хромосом: 1, 6, 9, 12-22 и Y во всех группах. В настоящем исследовании обнаружены при С-окрашивании редкие варианты хромосом (6ph+, 12cenh+, 18ph+, 19qh+, 20ph+ и 20qh+) (см. табл. 2). Носителями С-вариантов по хромосомам 6, 12 и 18 были женщины из разных групп супружеских пар. У матери ребёнка с ЗПМР и МАР был обнаружен хромосомный вариант 12cenh+. Женщина со спонтанными абортами была носителем редкого С-варианта 18ph+. Такие хромосомные варианты у супружеских пар, как 19qh+, 20ph+, были описаны ранее [3]. Известно, что размеры С-гетерохроматина таких хромосом, как 1, 9, 16, Y и всех акроцентриков, стабильны, сегрегируют в семье и кодоминантно наследуются [7]. Варианты хромосом 6, 12, 18, 19, 20 редки (см. табл. 2) и необходимо накапливать данные с этими С-вариантами у супружеских пар с НРФ для их изучения.

а

б

в

При обработке данных по 472 индивидуумам с С-вариантами мы получили в совокупности 758 хромосомных вариантов (см. табл. 2) по разным хромосомам, что в среднем составляет 1,6 на индивидуума. Анализируя все хромосомы с С-вариантами в отдельности, где их учитывали как в изолированном, так и в сочетанном состоянии (когда в кариотипе у индивидуума несколько вариантов), был получен удельный вес и определён вклад отдельной хромосомы в группу хромосом с С-вариантами. Как видно из табл. 2 и на рис. 1в, наиболее часто встречались варианты по хромосомам 9, 1 и 16. Так, 276 из обнаруженных 758 хромосомных вариантов были по хромосоме 9, что составило 36,4%; по хромосоме 1 - 176 (23,2%); по хромосоме 16 - 77 (10,2%), по хромосоме 15 - 61 (8,1%), по хромосоме Y - 47 (6,2%), по хромосоме 21 - 34 (4,5%) и по остальным хромосомам - 87 (11,4%). Таким образом, частыми хромосомами с С-вариантами были хромосомы: 9, 1 и 16. Анализируя С-варианты по каждой из этих хромосом, мы обнаружили, что среди выявленных хромосомных вариантов по хромосомам 1 (1qh-, 1qh+, 1phqh и 1phqhqh-) и 9 (9qh-, 9qh+, 9ph, 9phqh и 9phqhqh+) наиболее часто встречались инверсии 1phqh - 118 (67%) из 176 и 9phqh - 145 (52,5%) из 276, нежели экстремально увеличенные или уменьшенные гетерохроматиновые участки хромосом (С-варианты). Вариация в виде уменьшенного блока гетерохроматина в хромосоме 16 (16qh-) встречалась в 2 раза чаще, чем 16qh+.

При обнаружении экстремальных хромосомных вариантов индивидуумам из супружеских пар проводили количественную флюоресцентную гибридизацию in situ (QFISH) для определения вариаций числа копий ДНК. Этот метод использовали с применением ДНК пробы, специфичной для хромосомы 9 (D9Z4). На рис. 2 представлен пример анализа экстремального С-варианта (увеличения гетерохроматинового участка) хромосомы 9 методом QFISH. При измерении интенсивности двух гибридизационных сигналов пик интенсивности одного одиночного сигнала равнялся 187694 пикселя, а другого - 62229 пикселей. Соотношение интенсивности двух сигналов 3:1 свидетельствует о различии в содержании ДНК гетерохроматиновых участков гомологичных хромосом.

Маркирование вариабельного участка гетерохроматина хромосомы 1 с помощью флюоресцентной гибридизации in situ позволило количественно сравнить содержание ДНК в данном участке двух гомологичных хромосом. При молекулярно-цитогенетическом исследовании обнаружили 3-кратное увеличение гетерохроматинового района одного из гомологов за счёт вариаций числа копий последовательностей «классической» сателлитной ДНК. Было показано неспеци­фическое изменение в гетерохроматиновых районах, содержащих высокоповторяющиеся последовательности, т.е. увеличение числа копий «классической» сателлитной ДНК. Таким образом, вариации (гетероморфизм) гетерохроматина хромосомы 1 связаны с числом последовательностей «классической» сателлитной ДНК.

Молекулярно-цитогенетическое исследование (FISH) применяли также в случаях редко встречающейся перицентрической инверсии с использованием альфоидных центромерных ДНК зондов и сайт-специфичных ДНК зондов для локусов короткого и длинного плеч на хромосому 7 (MCG-P-2.6.Bst; MCG-P-405-01st; alphaR1-5mv). Описание этого исследования подробно изложено ранее [3], где отмечено, что инверсия привела к необычному положению центромерного гетерохроматина (двух блоков альфоидной ДНК) по отношению к эухроматину короткого и длинного плеч хромосомы 7, и, следовательно, изменению порядка расположения генов в соответствующих хромосомных участках. Аналогичная перицентрическая инверсия хромосомы 7 и различные её фенотипические проявления у здорового фенотипически нормального отца и больного ребенка может быть связана с эффектом положения генов. Поскольку непосредственного изменения последовательностей кодирующей ДНК в данном случае не наблюдается, то, вероятно, нарушение связано с изменением последовательности расположения генов в хромосомных участках, расположенных в непосредственной близости с перестроенным конститутивным гетерохроматином. Возможно, в подобных случаях необходимо дальнейшие исследования, такие как сравнительная геномная гибридизация (array CGH), которая позволит сканировать вариации генома на более высоком уровне разрешения и определить возможные изменения последовательности расположения генов в хромосомных участках [3, 10]. Этот случай демонстрирует необходимость изу­чения хромосомных вариантов и, прежде всего, проводить метод С-окрашивания при цитогенетическом исследовании, а при их обнаружении, по возможности, применять молекулярно-цитогенетические методы.

Заключение. Таким образом, при цитогенетическом исследовании 632 супружеских пар с НРФ хромосомные варианты обнаружили у 472 из 1264 обследованных индивидуумов, т.е. частота хромосомных вариантов составила 37,3%. Цитогенетическое исследование у супружеских пар с НРФ показало в группах: A, C, D, E, F и G 50 различных С-вариантов 15 хромосом: 1, 6, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 и Y, а также редко встречаемые 6ph+, 12cenh+, 17ps и 17ph+, 18ph+, 19qh+, 20ph+. Анализ гетероморфизма околоцентромерных гетерохроматиновых районов отдельных хромосом показал высокий удельный вес по хромосоме 9 - 36,4%; по хромосоме 1 - 23,2%; по хромосоме 16 - 10,2%. Результаты нашего исследования показали высокую частоту вариантов с НРФ у супружеских пар. Из работы можно сделать вывод о том, что необходимо проводить метод С-окрашивания при цитогенетическом исследовании и регистрировать все хромосомные варианты, включая редкие и инверсии околоцентромерного гетерохроматина для их изучения и подтверждения гипотезы об эффекте положения генов. В подобных случаях необходимо использовать сканирование генома с помощью ДНК микроматриц - новейшей технологии (серийной сравнительной геномной гибридизации) с целью определения геномных микроаномалий, что будет использовано в нашей дальнейшей работе [10]. Для определения связи хромосомных вариантов с НРФ у супружеских пар необходимы исследования с использованием новейших выше указанных технологий.

Работа поступила в редакцию 10.09.2012