Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Стресс является ярко выраженной адаптивной реакцией, но в то же время может быть причиной невротических, сердечно-сосудистых, эндокринных, иммунных и других заболеваний. Общеизвестно значение гипотоламо-гипофизарно-адренокортикальной системы, отвечающей за поддержания гомеостаза в различных условиях внешней среды. Ключевую роль в процессе адаптации выполняют надпочечники, поэтому их морфофункциональное состояние напрямую влияет на успешное формирование адаптивных механизмов [3, 7]. Интерес к изменениям надпочечных желез при холодовом стрессе объясняется чрезвычайным многообразием их функций и значимостью в регуляции углеводного, жирового и белкового обменов [1, 6].

Предупреждение или ограничение последствий стресса является важной задачей медицины, что расширяет задачи ученых в поисках средств, повышающих устойчивость организма в экстремальных условиях. На базе ТИНРО-Центра г. Владивостока создана биологически активная добавка «Тингол-2» (ТУ 9265-165-00472012-00, ТИ 36-150-2000) - спиртовый экстракт из кукумарии японской (ЭКЯ), содержащий тритерпеновые гликозиды не менее 550 мкг/см³ (патент РФ № 22110377). Тритерпеновые гликозиды голотурий проявляют широкий спектр биологической активности [2].

Целью исследования явилось изучение гистофункционального состояния надпочечников у стрессированных животных после многократного введения ЭКЯ.

Материалы и методы исследования

Эксперимент выполнен на 70 белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г, содержащихся в виварии при естественном световом режиме и свободном доступе к воде и пище, в осеннее-зимний период. Подопытные животные были разделены на 7 групп: 1 - интактные; 2 - интактные + острый стресс (контроль); 3 - экспериментальные животные, получавшие ЭКЯ в виде одной ежедневной добавки к основному корму в количестве 0,03 мл на 1 кг веса тела + острый стресс; 4 - интактные + стресс 5 дней (контроль); 5 - экспериментальные животные, получавшие ЭКЯ + стресс 5 дней; 6 - интактные + стресс 12 дней (контроль); 7 - экспериментальные животные, получавшие ЭКЯ + стресс 12 дней. Эксперименты выполнены согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР №755 от 12.08.1977). Холодовой стресс моделировали опусканием животных в холодную воду при температуре 6 ± 1 °С в течение часа однократно или многократно (до 12 дней по 1 разу в день) [1].

В настоящей работе исследовали эффект ЭКЯ на стадии тревоги (однократное пребывание в воде), стадии резистентности (5 дней стресс - воздействия) и стадии истощения (10 дней стресс - воздействия). После легкого эфирного наркоза крыс декапитировали с одномоментным забором крови для определения уровня кортизола в сыворотке крови. Для приготовления гистологических препаратов использовали левый надпочечник. Его извлекали тотчас после забоя, фиксировали в жидкости Карнуа. Серийные парафиновые срезы из средних слоев железы толщиной 7 мк окрашивали гематоксилином и эозином. Для выявления содержания нейтральных жиров получали срезы надпочечников на микротом-криостате МК-25 и окрашивали их суданом-3. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при уровне значимости меньше 0,05.

Общеизвестна огромная роль гормонов коры надпочечников в становлении и сохранении гомеостаза, а также их значение для адаптации организма при изменении состояния его внутренней и внешней среды. Кортизол является основным представителем глюкокортикоидов и нарушение обмена кортизола оказывает глубокое влияние на приспособленность организма [4]. У стрессированных животных 2-й группы острое стрессовое воздействие вызывало значительную активацию функции надпочечников, а именно, подъем уровня кортизола (85,7 ± 4,10 nmol/l, р < 0,05) в два раза по сравнению с интактными животными (45 ± 1,83 nmol/l). При остром холодовом воздействии наблюдали выраженную делипоидизацию коркового вещества. Вся сетчатая зона, нижняя и средняя треть пучковой зоны были лишены липидов, местами делипоидизация распространялась вплоть до наружных отделов пучковой зоны.

Известно, что увеличение размеров ядер в гормонпродуцирующих клетках свидетельствует об их повышенной секреторной активности. Кариометрические исследования показали значительное увеличение объема ядер клеток в пучковой зоне (ПЗ) коры надпочечника. Объем ядер достоверно выше, чем у интактных животных на 9,2%. Увеличение объема ядер клеток при незначительном увеличении объема цитоплазмы привело к приросту ядерно-цитоплазматического соотношения на 8,2%. Увеличение размеров клеток привело к небольшому расширению коркового вещества за счет расширения пучковой зоны (таблица). В клубочковой и сетчатой зонах при остром холодовом воздействии выраженных изменений в объемах ядер и цитоплазмы не наблюдали, что согласуется с мнением многих авторов.

Получение животными 3-й группы ЭКЯ ограничивало стрессовую реакцию в стадии тревоги, что проявилось менее выраженной гипертрофией клеток, а именно, достоверно меньшим увеличением объема ядер в клетках пучковой зоны (см. таблицу). У животных, получавших ЭКЯ, в надпочечниках не наблюдали тяжелых морфологических и, как следствие, функциональных нарушений. Последнее подтверждает уровень кортизола в крови стрессируемых животных, который составил 67,15 ± 3,32 nmol/l, р < 0,05. Этот показатель в два раза снижен по сравнению с контрольными животными 2-й группы, не получавшими пищевых добавок. Отсутствие выраженного функционального напряжения при остром стрессе также подтверждалось меньшей степенью делипоидизации коркового вещества, нежели у стресс-контрольных животных, только сетчатая зона и нижняя треть пучковой зоны были лишены липидов.

Влияние холодового стресса на морфометрические параметры коры надпочечников крыс и их коррекция ЭКЯ

Примечание:

* - значения достоверны по сравнению с интактными животными при р < 0,05;

** - значения достоверны по сравнению с животными контрольных групп при р < 0,05.

Воздействие холодового фактора в течение пяти дней привело к достоверному увеличению абсолютной и относительной массы надпочечников у крыс 4-й группы. Относительная масса надпочечников увеличилась на 31,2% при отсутствии в приросте массы тела. Цитологические исследования показали, что многократное воздействие холодового фактора вызывало увеличение объема ядер клеток клубочковой зоны на 11,3% и незначительное увеличение объема цитоплазмы при отсутствии в приросте ядерно-цитоплазматических соотношений. Площадь секреторных клеток пучковой зоны статистически достоверно увеличилась. Объем цитоплазмы клеток увеличился на 19,6%. Наряду с гипертрофией секреторных клеток наблюдали увеличение размеров ядер на 24,2% (см. таблицу).

На пятые сутки достоверно увеличился объем ядер клеток сетчатой зоны на 13,2%, а объем цитоплазмы имел небольшой прирост, что вызвало увеличение ядерно-цитоплазматических соотношений на 11,5%. Ширина коркового вещества на пятые сутки эксперимента увеличилась на 12,5%, за счет расширения пучковой зоны на 20,4% (см. таблицу). В пучковой зоне в результате отечных явлений и резкого расширения кровеносных капилляров выявлялась дискомплексация рядов клеток, стертость межзональных границ.

Коррекция стресса данной пищевой добавкой существенно ослабляла выраженность патоморфологических изменений в надпочечниках. Цитологические измерения адренокортикоцитов показали, что гипертрофия клеток коркового вещества стрессированных животных, принимавших ЭКЯ, нарастала постепенно. В пучковой зоне коркового вещества наблюдали умеренную гипертрофию клеток, которая проявилась достоверно меньшим увеличением объемов ядер и цитоплазмы, чем у стрессированных животных, не получавших ЭКЯ. У экспериментальных животных 5-й группы гипертрофия ядер в клетках пучковой зоны к пятым суткам эксперимента составила 8,1%, цитоплазмы - 11,3%, что привело к незначительному расширению пучковой зоны, ширина которой была достоверно меньше, чем в стресс-контроле на 12,7% (см. таблицу).

По данным гистологического изучения срезов надпочечников, отсутствовали признаки разволокнения соединительнотканной капсулы. В пучковой зоне клетки были сложены в трабекулы линейной формы и направлены к мозговому слою. На 5 сутки отмечали выраженное накопление липидов в верхней и средней трети пучковой зоны и в отличие от стресс-контрольных животных, у которых только в нижней трети пучковой зоны и в сетчатой зоне появились крупные липидные капли.

Многократные стрессовые воздействия холодового фактора на протяжении 12 суток на животных 6-й группы привели к уменьшению ширины коркового вещества по сравнению с предыдущим экспериментом и приблизились к ширине коркового вещества интактных животных, что по времени соответствовало снижению веса гипертрофированных надпочечников. Ширина пучковой зоны не имела достоверных отличий от ширины этой зоны у интактных животных. Ширина клубочковой зоны достоверно ниже, чем у животных 1-й группы (см. таблицу).

Цитологические исследования показали, что к 12 суткам эксперимента гипертрофия клеток ослабевала и объем ядер и цитоплазмы клеток в клубочковой зоне надпочечника существенно не отличался от показателей интактной группы. Исследование клеток пучковой зоны также выявило тенденцию к уменьшению объема цитоплазмы и объема ядер адренокортикоцитов (см. таблицу). Гормональными критериями фазы «максимального напряжения», что предшествует стадии истощения, на 12 сутки можно считать трехкратное повышение уровня кортизола у крыс в стресс-контроле (92,5 ± 2,76 nmol/l), что согласуется с данными литературы.

Гистологическая картина надпочечников крыс, подвергнутых хроническому холодовому стрессу, существенно отличалась от группы сравнения. В большинстве случаев соединительнотканная капсула была резко истончена, имелись признаки отека и разволокнения. Зональная структурная организация была нарушена. Нарушалась столбчатость расположения клеток в пучковой зоне (рис. 1). Часть ядер кортикоцитов имели неправильную «лопастную» форму, что является морфологическим свидетельством крайнего функционального напряжения клеток [6]. Наблюдали гиперхромию ядер и кариопикноз в клетках пучковой зоны, а также определяли безъядерные участки вследствие очагового некроза. К 12 суткам наблюдали полное отсутствие липидных капель в клубочковой и сетчатой зонах и только в средней трети пучковой зоны определялись клетки с мелкокапельной и пылевидной концентрацией жировых включений, что, по мнению ряда авторов, свидетельствует об угнетении функциональной активности надпочечников [3, 6]. Анализируя полученные данные, можно предположить, что к 12 суткам эксперимента у стресс-контрольных животных 6-й группы появились начальные признаки перехода стадии резистентности к стадии истощения. К этому времени в группе стресс-контроля гибель животных составила 31,2%.

Рис. 1. Кора надпочечника на 12 сутки холодового воздействия у крыс стресс-контрольной группы (6 группа) Окр. г.-э., ув. x 100

Получение животными 7-й группы биологической добавки, содержащей тритерпеновые гликозиды, оказывало заметное положительное действие на кору надпочечников. В клубочковой зоне объемы ядер и цитоплазмы имели достоверные отличия по сравнению со стресс-контролем. Размеры клубочковой зоны коры преобладали над размерами этой зоны у крыс, не получавших ЭКЯ. Сохранялась гипертрофия клеток в пучковой зоне за счет сохранения гипертрофии ядер и цитоплазмы (см. таблицу). Пучковая зона оставалась умеренно гипертрофированной по сравнению с интактными животными и достоверно отличалась от стресс-контроля на 22,9%. Постепенное нарастание гипертрофии клеток на протяжении всего эксперимента, сохранение умеренной гипертрофии к 12 суткам опыта, статистически значимые отличия от стресс-контроля, свидетельствовали о сохранении функциональных резервов в секреторных клетках. У экспериментальных животных уровень кортизола более стабилен и достоверно ниже по сравнению со стресс-контролем (68,0 ± 1,50 nmol/l). Гибель экспериментальных животных к окончанию эксперимента составила 8%, что значительно меньше, чем в контроле. Получение крысами биологически активной добавки уменьшало выраженность морфологических изменений коры надпочечников. Граница между клубочковой и пучковой зонами сохранилась почти на всем протяжении (рис. 2). Адренокортикоциты пучковой зоны не претерпевали выраженных изменений и были сложены в трабекулы линейной формы. Явления умеренной липидной насыщенности коры свидетельствовали о сохранении функций этой зоны. К 12 суткам уровень кортизола у самцов 6-й группы составил 92,5 ± 2,50 nmol/l, тогда как у экспериментальных животных 7-й группы - 77,0 ± 4,0 nmol/l, р < 0,05. На основании полученных данных можно сказать, что к 12 суткам холодового воздействия у стресс-экпериментальных животных отмечали постепенное нарастание гипертрофии надпочечников, отсутствие потерь в весе тела, что и привело к формированию более выраженной стадии резистентности.

Гипертрофия надпочечников, осуществляемая за счет усиления кровенаполнения и увеличения паренхиматозной массы коркового вещества, занимает центральное место в изменениях, происходящих при хроническом стрессе на структурном уровне [5, 6]. Введение биологически активной добавки, содержащей тритерпеновые гликозиды, оказывало положительное влияние на течение стресс-реакции в коре надпочечников, не вызывало выраженных структурных изменений в коре, стабилизировало секреторную активность глюкокортикоидпродуцирующих клеток, а также способствовало сохранению умеренной липидной насыщенности.

Таким образом, сохраняя резервные возможности секреторных клеток, экстракт из кукумарии японской повышает устойчивость коры надпочечника к действию экстремальных факторов и оказывает адаптогенный эффект.

• Матвеева Н.Ю., д.м.н., профессор, зав. кафедрой гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО ВГМУ, г. Владивосток;
• Хасина М.А., д.м.н., профессор кафедры биологической химии, клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии ГБОУ ВПО ВГМУ, г. Владивосток.

Работа поступила в редакцию 09.08.2012.