Несмотря на то, что эозинофилия не является характерным симптомом бактериальных инфекций, туберкулез легких нередко сопровождается возникновением данной гематологической реакции. Доказано также присутствие эозинофильных лейкоцитов в составе гранулемы, образующейся в легочной ткани при внедрении Micobacterium tuberculosis.
Эозинофилы - агрессивные эффекторные клетки - при активации экспрессируют на своей поверхности разнообразные рецепторные структуры, опосредующие их вовлечение и миграцию в очаг воспаления, секретируют широкий спектр цитотоксических протеинов: главный основной протеин, эозинофильный катионный протеин, эозинофильный нейротоксин и эозинофильную пероксидазу [8]. Последняя при участии перекиси водорода, галогенидов и псевдогалогенидов формирует потенциальную цитотоксическую систему, эффективную против бактерий [2]. В современной литературе представлены также данные о фагоцитарных свойствах эозинофильных клеток. Несмотря на меньшую фагоцитарную активность, чем у макрофагов и нейтрофилов, эозинофилы способны осуществлять эффективное поглощение вирулентных и авирулентных штаммов микобактерий [5, 8].
Современные знания о функциональных возможностях эозинофильных гранулоцитов позволяют рассматривать эти малоизученные (в контексте бактериальной инфекции) клетки в качестве полноценных участников эффекторных механизмов антибактериальной защиты.
В связи с этим, целью настоящего исследования явилась оценка цитотоксических свойств, фагоцитарной и адгезионной способности эозинофильных гранулоцитов при туберкулезе легких.
Материал и методы исследования
Под наблюдением находилось 35 больных с впервые выявленным распространенным деструктивным туберкулезом легких (инфильтративный, диссеминированный) в возрасте от 18 до 55 лет. Диагноз устанавливали на основании клинической картины заболевания, рентгенологического исследования органов грудной клетки, данных микроскопического и бактериологического анализа мокроты. В зависимости от абсолютного и относительного количества эозинофилов в периферической крови были сформированы две основные группы исследования: первую группу составили 16 пациентов с туберкулезом легких, сопровождающимся эозинофилией (абсолютное число эозинофилов соответствовало (0,85 ± 0,01) Г/л, относительное - (8,00 ± 0,46)%), во вторую группу вошли 19 больных туберкулезом легких без эозинофилии (абсолютное число эозинофилов - (0,29 ± 0,01) Г/л, относительное - (3,00 ± 0,30)%).
Группу сравнения (контроль) составили 14 здоровых доноров (абсолютное число эозинофилов - (0,07 ± 0,01) Г/л, относительное - (1,23 ± 0,30)%), сопоставимых по полу и возрасту.
Все обследованные лица отрицали наличие в анамнезе аллергических заболеваний, отягощенной наследственности, лекарственной и пищевой аллергии. При проведении иммуноферментного анализа у всех обследованных лиц диагностически значимых титров антител (иммуноглобулинов класса G) к антигенам описторхисов, трихинелл, токсокар и эхинококков в сыворотке крови не обнаруживалось.
Все исследования у больных туберкулезом легких проводили до начала специфической противотуберкулезной терапии.
Материалом исследования служила венозная кровь. Все исследования проводили на эозинофильных гранулоцитах, предварительно выделенных на прерывистом градиенте плотности Percoll (p = 1,133 г/л) («Sigma Life Science», США). Для определения уровня экспрессии CD9 и CD18 на мембране эозинофильных гранулоцитов применяли метод лазерной проточной цитометрии с использованием меченых моноклональных антител к соответствующим рецепторным структурам. Процедуру окрашивания поверхностных маркеров проводили согласно протоколу фирмы-производителя («Becton Dickinson», США). Для оценки фагоцитарной способности эозинофилов пробоподготовку осуществляли согласно инструкции, прилагаемой производителем тест-системы PHAGOTEST («Glycotope Biotechnology GmbH», Германия). Измерения производили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США), укомплектованном аргоновым лазером длиной волны 488 нм и стандартными фильтрами. Анализ полученных данных осуществляли при помощи программного приложения BD: CellQuest for Mac OS® X. Активность пероксидазы в лизате эозинофильных гранулоцитов оценивали по методу, предложенному E. Sato в модификации D. Quaglino. Результаты исследования обрабатывали с использованием стандартного пакета программ Statistica 6.0.
Результаты исследования и их обсуждение
Привлечение эозинофилов в очаг гранулематозного воспаления осуществляется при участии хемокинов, экспрессии соответствующих рецепторов и молекул адгезии на мембране клеток. Посредством L-селектина и сиалил-LeX осуществляется первоначальное прикрепление и «роллинг» циркулирующих эозинофилов in vivo [9]. Прочная адгезия и трансмиграция эозинофилов через сосудистый эндотелий обеспечивается молекулами адгезии семейства β2- (CD11а/CD18 (Mac-1) и CD11b/CD18 (LFA-1)) и β1- интегринов (VLA-4), а также CD9 (семейство тетраспанинов). Последние имеют наибольшее значение в агрегации эозинофильных гранулоцитов и их адгезии к фибронектину [4]. По данным литературы, при воспалении происходит значительное усиление экспрессии α- и β-цепей интегрина Mac-1, CD66b и CD9 на мембране эозинофилов, тогда как презентация других молекул адгезии (CD69, CD29, CD49b и CD44) существенно не изменяется [1].
Проведенное нами in vitro исследование уровня экспрессии молекул CD9 и CD18 (общая субъединица Mac-1, LFA-1 и CR4) на эозинофилах, выделенных из крови больных туберкулезом легких, позволило констатировать достоверное увеличение абсолютного и относительного количества CD18-позитивных клеток у больных туберкулезом легких с эозинофилией и без таковой. Количество эозинофилов, несущих молекулу CD9, у всех больных соответствовало контрольным значениям. При этом у пациентов с туберкулезом легких, сопровождающимся эозинофилией, содержание CD18-презентирующих эозинофилов достоверно превышало аналогичный параметр у больных без эозинофилии (табл. 1).
Это может быть связано со способностью IL-5 (концентрация которого оказалась достоверно повышенной у больных туберкулезом с эозинофилией) усиливать экспрессию на мембране эозинофилов Mac-1 и LFA-1, имеющих общую субъединицу (CD18).
На ряду с молекулами адгезии эозинофильные гранулоциты презентируют toll-подобные рецепторы типа 2 (TLR-2) и γδT-клеточный рецептор, посредством которых они взаимодействуют с M. tuberculosis, в результате чего происходит высвобождение α-дефензинов и эозинофильной пероксидазы, обладающих выраженным бактерицидным действием [4, 5]. Используя перекись водорода, галогениды (бромид, хлорид или иодид) и псевдогалогениды (тиоционат), эозинофильная пероксидаза опосредует образование высокореакционных продуктов, взаимодействующих с тиоловыми группами клеточной стенки бактерий, что приводит к усилению её проницаемости. В свою очередь, анион гипотиоциановой кислоты, образующийся в ходе реакции, блокирует гликолиз и НАДФ-зависимые реакции бактерий [1]. Эозинофильная пероксидаза способна также потенцировать цитотоксичность лизосомальных катионных белков, которые повышают клеточную проницаемость, усиливают хемотаксис лейкоцитов в очаг воспаления, опосредуют фагоцитарную активность клеток [3].
Таблица 1. Содержание CD9- и CD18-позитивных эозинофилов в крови у больных туберкулезом легких (Me (Q1-Q3))
|
Группы обследованных лиц |
Ед. |
CD9-позитивные эозинофилы |
CD18-позитивные эозинофилы |
|
Здоровые доноры |
% |
3,020 (2,010-3,740) |
5,360 (3,370-6,750) |
|
×109 |
0,002 (0,001-0,002) |
0,003 (0,002-0,004) |
|
|
Больные туберкулезом легких с эозинофилией |
% |
3,386 (3,125-5,120) р1 > 0,05 |
21,540 (19,49-24,36) р1 < 0,05 |
|
×109 |
0,036 (0,310-0,050) р1 > 0,05 |
0,204 (0,185-0,273) р1 < 0,05 |
|
|
Больные туберкулезом легких без эозинофилии |
% |
4,425 (3,620-5,193) р1 > 0,05 р2 > 0,05 |
12,670 (9,85-20,48) р1 < 0,05 р2 < 0,05 |
|
×109 |
0,009 (0,008-0,010) р1 > 0,05 р2 > 0,05 |
0,027 (0,020-0,043) р1 > 0,05 р2 < 0,05 |
Примечание. Здесь и в табл. 2, 3: р1 - уровень статистической значимости различий по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров; р2 - у больных туберкулезом легких с эозинофилией.
Изучение активности эозинофильной пероксидазы при туберкулезе легких позволило констатировать снижение данного показателя у всех больных, независимо от наличия эозинофильной реакции крови (по сравнению с нормой) (табл. 2). Данные изменения могут являться следствием усиления функциональной активности эозинофильных клеток, обладающих повышенной чувствительностью к различным эндо- и экзогенным стимулам, что способствует их дегрануляции. При этом у больных туберкулезом легких, сопровождающимся эозинофилией, активность эозинофильной пероксидазы оказалась достоверно выше, чем у больных туберкулезом без эозинофилии (табл. 2). Данный факт позволяет судить о более высоком цитотоксическом потенциале эозинофильных клеток, реализация которого может иметь несомненно позитивное значение, опосредуя повреждение и эффективный лизис М. tuberculosis. Однако цитотоксические протеины, высвобождающиеся при дегрануляции эозинофилов, способны инициировать специфические морфологические изменения легочной ткани, оказывать повреждающее действие на эндотелий сосудов и миелиновые нервные волокна, стимулировать процессы фиброзирования и тем самым осложнять течение инфекционного процесса [6].
Таблица 2. Активность пероксидазы эозинофильных гранулоцитов у больных туберкулезом легких, мккат/г (Me (Q1-Q3))
|
Группы обследованных лиц |
Содержание эозинофилов в периферической крови |
|
Здоровые доноры |
236,17 (181,50-299,80) |
|
Больные туберкулезом легких с эозинофилией |
142,13 (114,5-181,15) р1 < 0,05 |
|
Больные туберкулезом легких без эозинофилии |
96,65 (85,10-176,50) р1 < 0,05 р2 < 0,05 |
Противомикробный потенциал эозинофильных гранулоцитов может быть реализован за счет способности этих клеток к фагоцитозу. Известно, что эозинофилы поглощают бактерии с последующим их расщеплением путем генерации высокотоксичных супероксидных и нитроксидных радикалов, инициирующих процессы перекисного окисления мембранных липидов бактериальной стенки. Вместе с тем процесс деградации микробной клетки происходит под влиянием кислой реакции, создаваемой внутри фаголизосомы при участии гидролитических ферментов и лизосомальных белков [4, 7].
В ходе настоящего исследования было зарегистрировано увеличение содержания фагоцитирующих эозинофилов у больных туберкулезом легких с эозинофилией и без таковой. При этом абсолютное содержание фагоцитирующих клеток у больных туберкулезом, сопровождающимся эозинофилией, достоверно превышало соответствующий параметр у больных, в крови которых количество эозинофилов соответствовало норме (табл. 3). Полученные нами данные согласуются с результатами Л.С. Литвиновой и соавт. [2007], констатирующими факт увеличения числа эозинофилов с высоким биоцидным потенциалом (по отложению гранул диформазана в НСТ-тесте) у лиц, страдающих лимфопролиферативными заболеваниями системы крови, и у пациентов с описторхозом, ассоциированными с эозинофилией крови. Усиление фагоцитарной активности эозинофильных гранулоцитов крови при заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы опосредует эффективную элиминацию патогена (в том числе микобактерий) из организма. Однако, учитывая способность особо вирулентных М. tuberculosis снижать бактерицидный потенциал эффекторных клеток, высока вероятность формирования незавершенного фагоцитоза, в результате чего эозинофилы могут являться дополнительным резервуаром персистенции микобактерий.
Таблица 3. Фагоцитарная активность эозинофилов крови у больных туберкулезом легких (Me (Q1-Q3))
|
Группы обследованных лиц |
Ед. |
Содержание эозинофилов в периферической крови |
Количество фагоцитирующих E. coli эозинофилов |
|
Здоровые доноры |
% |
1,230 (0,890-1,570) |
8,790 (6,170-10,340) |
|
×109 |
0,070 (0,030-0,080) |
0,006 (0,004-0,007) |
|
|
Больные туберкулезом легких с эозинофилией |
% |
8,810 (6,870-12,830) р1 < 0,05 |
19,290 (16,200-23,350) р1 < 0,05 |
|
×109 |
0,950 (0,740-1,390) р1 < 0,05 |
0,178 (0,149-0,234) р1 < 0,05 |
|
|
Больные туберкулезом легких без эозинофилии |
% |
2,110 (1,230-3,790) р1 > 0,05 р2 < 0,05 |
13,030 (9,810-15,520) р1 < 0,05 р2 > 0,05 |
|
×109 |
0,210 (0,110-0,370) р1 < 0,05 р2 < 0,05 |
0,027 (0,018-0,320) р1 < 0,05 р2 < 0,05 |
Таким образом, при туберкулезе легких (особенно в сочетании с эозинофильной реакцией крови) эозинофильные гранулоциты обладают высокой активностью в отношении дальнейшей аккумуляции в очаге гранулематозного воспаления (за счет повышенной экспрессии молекул адгезии) с последующей реализацией своего микробицидного потенциала, действие которого может быть направлено как в отношении бактерий, так и «здоровой» ткани легкого.
Выводы
-
У больных туберкулезом легких вне зависимости от наличия эозинофильной реакции крови усиление адгезивных свойств и фагоцитарной функции эозинофилов сочетается с понижением активности эозинофильной пероксидазы.
-
У больных туберкулезом легких с эозинофилией содержание CD18-презентирующих эозинофилов и активность эозинофильной пероксидазы выше, чем у больных без эозинофилии.
Исследование выполнено в рамках реализации Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 го- ды (Соглашения №14.А18.21.0206 и №14.А18.21.0174).
Рецензенты:
-
Карпова М.Р., д.м.н., профессор кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, г. Томск;
-
Филинюк О.В., д.м.н., доцент, и.о. зав. кафедрой фтизиатрии и пульмонологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, г. Томск.
Работа поступила в редакцию 28.07.2012.