Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Ревматические заболевания (РЗ) занимают важное место в структуре заболеваемости населения и имеют огромное социально-экономическое значение [4]. Хроническое прогрессирующее, нередко инвалидизирующее течение большинства РЗ ставит перед врачами задачу возможно более ранней клинико-лабораторной диагностики. Однако распознавание РЗ на ранней стадии представляет значительные трудности (не найдено строго специфичных лабораторных тестов, при диагностике РЗ следует опираться только на сочетание многих клинических и лабораторных признаков и т.д.). В связи с этим остается актуальной проблема как ранней диагностики начальных проявлений активации и прогрессирования патологического процесса, так и своевременной диагностики поражения отдельных органов и систем у ревматических больных [2].

В настоящий момент сохраняется интерес к изучению метаболизма пуриновых соединений в норме и при патологии [1]. Это связано не только со значением данного цикла в обмене нуклеиновых кислот, но и с той важной биологической ролью, которую выполняют его отдельные, составные части: ферменты и промежуточные субстраты. Так хорошо известно, что с активностью ряда ферментов гуаниновой ветви пуринового метаболизма (ПМ) связаны процессы созревания Т-клеток и развитие Т-клеточного иммунитета в организме, процессы деградации пуринового нуклеозида - гуанозина, обладающего выраженными регуляторной и физиологической активностями. В то же время процессам аутоантителообразования к ферментам гуаниновой ветви ПМ при РЗ уделяется значительно меньшее внимание. В связи с этим представляется перспективным комплексное исследование у больных системными РЗ антител к основному энзиму гуаниновой ветви пуринового метаболизма (ПМ) - гуаниндезаминазе (ГДА), так- же антител к 5'-нуклеотидазе (5'-НТ) и пуриннуклеозидфосфорилазе (ПНФ), принимающих участие в распаде гуанозина.

Целью работы явилась разработка дополнительных критериев иммунодиагностики висцеральных проявлений ревматоидного артрита (РА) и системной красной волчанки (СКВ) с использованием иммобилизированных антигенных наносистем (АНС) на основе пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ, ЕС 2.4.2.1), 5'-нуклеотидазы (5'-НТ, ЕС 3.1.3.5) и гуаниндезаминазы (ГДА, ЕС 3.5.4.3) в качестве антигенной матрицы.

Материалы и методы исследования

В исследование было включено 30 практически здоровых лиц - доноров станции переливания крови (группа контроля), 89 больных РА и 60 больных СКВ. Диагноз РА и СКВ ставился на основании критериев АСR/EULAR 2010 г. [5] и критериев Американской ревматологической ассоциации, пересмотренных в 1982 году и дополненных Американской коллегией ревматологов в 1997 г. [6], соответственно.

Под наблюдением находились 89 больных РА, из которых 63 (70,8%) женщины и 26 (29,2%) мужчин. Средний возраст больных - 48,9 ± 13,2 года. Инвалидность по основному заболеванию (РА) установлена у 34 (38,2%) больных. Средняя продолжительность РА составила 11,14 ± 2,33 года. I (минимальная) степень активности выявлена у 17 (19,1%), II (умеренная) - у 64 (71,9%) и III (максималь- ная) - у 8 (9%) больных РА.

На основании результатов проведенного комплексного клинико-инструментального и иммуно-биохимического обследования больных РА внесуставные проявления выявлены у 34 (38,2%) пациентов. Наиболее часто отмечались поражения ретикуло-эндотелиальной системы (анемия, полиаденопатия, спленомегалия) - у 12 (35,29%); почек (нефрит, гломерулосклероз) - у 12 (35,29%); сердца (миокардит, миокардиодистрофия) - у 11 (32,35%) больных; легких (адгезивный плеврит, пневмосклероз) - у 5 (14,71%); полинейропатия - у 7 (20,59%); ревматоидный васкулит отмечен у 8 (23,53%) больных.

Наиболее часто у больных РА наблюдался суставной синдром, характеризующийся симметричным поражением суставов, включающий утреннюю скованность, боли при движениях и при пальпации, ограничение движений в пораженных суставах и их припухлость. Чаще поражались мелкие суставы кистей и стоп, лучезапястные и коленные суставы. У большинства больных (91,01%) выявлялся полиартрит. У 65 (73,03%) больных в крови методом латекс-агглютинации был обнаружен ревматоидный фактор (РФ) класса IgM.

Также под наблюдением находилось 60 больных СКВ. Средний возраст больных СКВ составил 36,32 ± 15,27 (М ± SD) лет, средний возраст лиц контрольной группы (30 доноров крови) - 26,0 ± 5,56 лет. Среди больных СКВ преобладали женщины (91,7%), абсолютное большинство составляли лица трудоспособного возраста (90%). Продолжительность СКВ составила 7,97 ± 7,36 лет, возраст дебюта болезни 28,5 ± 13,2 лет.

Активность СКВ оценивалась с помощью индексов SLEDAI (исходный показатель, М ± SD: 8,9 ± 5,7; 95% доверительный интервал для М - 7,5...10,4) и ECLAM (исходный показатель, М ± SD: 5,3 ± 2,8; 95% доверительный интервал для М - 4,6...6,0), а также по критериям, предложенным В.А. Насоновой (1985 г.): низкая - 9, умеренная - 34, высокая - 17 человек. Повреждение (необратимые изменения в состоянии здоровья) измерялось с помощью индекса SLICC/ACR (исходный показатель, М ± SD: 1,9 ± 1,7; 95% доверительный интервал для М - 1,5...2,4). При оценке течения СКВ по критериям В.А. Насоновой были получены следующие результаты: у 2 пациентов имело место острое течение СКВ, у 44 - подострое, у 14 - хроническое.

Объектом исследований служила сыворотка крови. Для определения активности 5-НТ использовалась методика, предложенная Wood R., Williams D. (1981), основанная на измерении количества неорганического фосфора в результате дефосфорилирования АМФ под влиянием 5¢-НТ. Активность ПНФ определялась по методике Robertson B.C. и Hoffe P.A. (1973). Для определения активности гуаниндезаминазы использовалась методика Caraway W.T. (1966), основанная на колориметрическом определении свободного аммиака, образующегося при дезаминировании гуанина в ксантин, с использованием цветной реакции Бертелота.

Антитела к ПНФ, 5-НТ и ГДА выявляли твердофазным иммуноферментным анализом в модификации Гонтаря И.П. и соавт. (2002) с использованием АНС, для получения которых применяли метод эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала и соответствующей антигенной матрицы.

Предварительно нами были определены оптимальные условия получения и применения АНС:

1. АНС создавались на основе 20% полиакриламидного геля и представляли собой гранулы сферической формы размером 10-100 мкм;
2. антигенную матрицу АНС формировали, используя водные растворы антигенов: оптимальная концентрация для 5-НТ составила 100 мкг/мл, для ПНФ - 50 мкг/мл, для ГДА - 20 мкг/мл;
3. изучение влияния времени хранения на АНС с белковой матрицей показало, что максимальное количество белка удаляется из полиакриламидных гранул на 2-3 сутки хранения, а затем процесс резко замедляется; общее количество антигена, оставшееся в гранулах после 6 суток хранения, составило в среднем 96,6%, после 30 су- ток - 95,3%;
4. потери иммобилизированного антигена из АНС изучали при температуре + 4,20 и 37 °С; реальные потери белка при максимальной температуре составили 0,095%. По-видимому, на поверхности гранул АНС имеются молекулы антигена, частично включенные в пространственную решетку геля, а при хранении и воздействии разных температур полиакриламидный гель несколько набухает, что и приводит к потерям белка.

Предварительно, установив среднюю концентрацию антител к изучаемым ферментам в 30 донорских сыворотках, вычислили уровень нормальных показателей оптической плотности (M ± 3s). Значения оптической плотности 0,08 е.о.п. для 5-НТ, 0,097 е.о.п. для ПНФ и 0,072 е.о.п. для ГДА (в ELISA-тесте с использованием АНС) были приняты за верхнюю границу нормы (показатели, превышающие эти значения, считались положительными по соответствующим антителам).

Количество больных РА с повышенным уровнем антител к 5'-НТ составило 53,9% (48 человек), к ПНФ - 59,5% (53 человек), к ГДА - 44,9% (40 человек). У больных РА (при поступлении на лечение) по сравнению со здоровыми лицами обнаружено увеличение содержания антител к 5-НТ, ПНФ и ГДА (p < 0,0001). По окончании курса стационарного лечения, на фоне улучшения клинического состояния больных, содержание антител к 5-НТ и ПНФ существенно уменьшилось (i < 0,001), но, тем не менее, оставалось выше показателей здоровых лиц (p < 0,001). Также была отмечена тенденция к снижению уровня антител к ГДА (р > 0,05) (табл. 1).

Примечание: А - до лечения; Б - после лечения

Клинико-лабораторное многообразие РА обусловили целесообразность более детального рассмотрения изучаемых показателей в зависимости от различных клинических форм заболевания. Примечательно, что проведение дисперсионного анализа позволило выявить зависимость уровней антител к 5-НТ, ПНФ и ГДА от выраженности ревматоидного васкулита (р = 0,006, р = 0,005, р = 0,002, соответственно); уровней Ат к 5-НТ и Ат к ПНФ от тяжести поражения органов сердечно-сосудистой системы (ССС) (р = 0,041, р = 0,017, соответственно); уровней антител к 5-НТ и антител к ПНФ от тяжести поражения почек (р = 0,017, р < 0,0001, соответственно), а также зависимость уровней антител к ПНФ и антител к ГДА от тяжести поражения печени (р = 0,007, р = 0,001, соответственно).

Следует отметить, что ревматоидный васкулит отмечался значительно чаще в группах больных с повышенным содержанием всех исследуемых антител (для антител к 5-НТ c² с поправкой Йетса = 5,61, р = 0,0179; для антител к ПНФ c² с поправкой Йетса = 4,27, р = 0,0388; для антител к ГДА c² с поправкой Йетса = 8,46, р = 0,0036).

При поступлении на лечение больных СКВ (группа в целом) по сравнению со здоровыми лицами обнаружено увеличение содержания антител к ПНФ, 5-НТ и ГДА (p = 0,005, р = 0,009, р < 0,001 соответственно дисперсионный анализ в варианте с неравными дисперсиями) (табл. 1). При анализе содержания антител к изучаемым ферментам были выявлены статистически значимые корреляции с показателями активности СКВ (табл. 2).

Антитела к ПНФ были выявлены у 25 (41,7%) больных СКВ и коррелировали со снижением активности ПНФ в сыворотке крови (r = -0,72; p < 0,001). В группе больных СКВ, имеющих повышенные уровни антител к ПНФ, наблюдалось достоверно более частое поражение почек (c² с поправкой Йетса = 7,34, р = 0,006) и сердечно-сосудистой системы (c² с поправкой Йетса = 3,78, р = 0,048). Несколько чаще, но статистически незначимо, у больных с наличием анти-ПНФ отмечалось поражение мышц (p = 0,064). Более частое обнаружение антител к ПНФ у больных СКВ с поражением почек, положительная корреляционная связь с величиной протеинурии при этом заболевании, а также положительная динамика уровня антител к ПНФ на фоне терапии могут служить косвенными доказательствами важной роли данных антител в патогенезе нефропатии при СКВ. Наряду с этим, при анализе подгрупп больных СКВ с продолжительностью заболевания менее 1 года антитела к ПНФ были обнаружены у 40% (2 из 5) больных.

Количество больных СКВ с повышенным уровнем антител к 5-НТ составило 53,3% (32 человека). Анализ связей уровня антител к 5-НТ с лабораторными показателями позволил выделить ряд статистически значимых корреляций: с протеинурией (r = 0,27; p = 0,039), лейкоцитурией (r = 0,35; p = 0,012) и эритроцитурией (r = 0,29; p = 0,026), что позволяет рассматривать антитела к 5-НТ в качестве дополнительного индикатора волчаночной нефропатии. Сравнение между собой групп больных СКВ, позитивных и негативных по наличию антител к 5-НТ, продемонстрировало статистически достоверное увеличение частоты выявления признаков поражения почек (р = 0,032) и ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС) (р = 0,021). Среди пациентов с наличием антител к 5-НТ была отмечена большая доля больных с наличием васкулопатии (р = 0,053). Несколько чаще, но статистически недостоверно, у больных СКВ с наличием антител к 5-НТ отмечались признаки поражения вегетативной нервной системы (p = 0,115).

Количество больных СКВ с повышенным уровнем антител к ГДА составило 46,7% (28 человек). При СКВ отмечена положительная корреляция уровня антител ГДА со значениями индекса SLEDAI (r = 0,361) и отрицательная корреляция с биохимической активностью гуаниндезаминазы в сыворотке крови (r = -0,35). Наиболее высокие уровни антител к ГДА отмечались у больных СКВ с поражением печени (р = 0,024) и у больных с выраженным цитопеническим синдромом (р = 0,039).

В патогенезе воспалительных РЗ важную роль играют разнообразные иммунологические нарушения, которые в значительной степени определяют клинический вариант, характер течения и прогноз данного заболевания. Большое количество антител, направленных против различных антигенов и клеточных структур, часто ассоциируется с определенными клиническими проявлениями РЗ и используется в клинической практике для диагностики конкретного заболевания и выделения сходных по патогенезу и прогнозу клинических подклассов [3].

В настоящем исследовании нам впервые удалось продемонстрировать связь ферментных и иммунных механизмов развития ревматоидного артрита через выработку антител к основным ферментам гуаниновой ветви пуринового катаболизма (5-НТ, ПНФ и ГДА). Достаточный процент положительных результатов определения антител к 5-НТ, ПНФ и ГДА у больных РА и СКВ позволяет предположить, что механизм образования аутоантител к данным ферментам должен подчиняться общим закономерностям индукции аутоантител при аутоиммунной патологии.

Было установлено, что ревматоидный васкулит отмечается значительно чаще в группах больных РА с повышенным содержанием всех исследуемых антител (для антител к 5-НТ р = 0,0179; для антител к ПНФ р = 0,0388; для антител к ГДА р = 0,0036). Кроме того, сравнение между собой групп больных РА, позитивных и негативных по антителам к 5-НТ, продемонстрировало большую тяжесть поражения почек, сердца и органов РЭС (р < 0,05) у больных, имевших антитела к 5-НТ. Определенный интерес вызывает связь данных клинических проявлений и известными, по данным литературы, симптомами у больных с наличием антинуклеарных антицитоплазматических антител, которые чаще обнаруживаются именно при тяжелых формах РА, протекающих с синдромами Фелти и Шегрена, а также при некоторых системных васкулитах. Показано, что анти-ANCA встречаются у 30% больных РА с поражением почек и только у 9% пациентов, не имеющих нефропатии, а также часто коррелируют с тяжестью почечного поражения. Учитывая то, что 5-НТ является цитоплазматическим энзимом, связанным с клеточной мембраной, можно подтвердить высказанные ранее предположения, что антитела к 5-НТ являются отдельным видом антицитоплазматических антител, определяемых при РА.

В патогенезе разнообразных почечных нарушений при РЗ могут играть роль иммунные комплексы и антинейтрофильные цитоплазматические антитела. Мезангиальный нефрит с депозитами IgA и IgM связывают с высокими уровнями ревматоидных факторов, принадлежащих к данным классам иммуноглобулинов. Отмечено, что больные РА с поражением почек чаще серопозитивны по перинуклеарным антинейтрофильным цитоплазматическим антителам по сравнению с больными без нефропатии. Более частое обнаружение антител к 5-НТ и ПНФ у больных РА и СКВ с поражением почек, положительная корреляционная связь с величиной протеинурии при этом заболевании, а также положительная динамика антител к 5-НТ и ПНФ на фоне терапии могут служить косвенными доказательствами важной роли данных антител в патогенезе нефропатии при РА и развитии нефрита при СКВ.

Учитывая то, что определение антител к индивидуальным антигенам методом иммуноферментного анализа с использованием иммобилизированной формы антигена обладает большей чувствительностью и специ­фичностью для целого ряда ревматических заболеваний по сравнению с классическим вариантом иммуноферментного анализа (ИФА) и иммунофлюоресценцией (ИФЛ), дающей информацию только об их локализации в клетке, можно надеяться, что определение антител к 5-НТ, ПНФ и ГДА расширит возможности лабораторной диагностики РА и СКВ.

Выявленная достоверная зависимость между количеством антител к 5-НТ, ПНФ, ГДА и клиническими вариантами РА и СКВ может быть связана с теми обстоятельствами, что более высокие значения антител к данным ферментам коррелируют с более тяжелым течением воспалительных РЗ, характеризующимся большей иммунологической активностью. Другой возможной причиной зависимости клинических проявлений РА и СКВ от уровня антител к 5-НТ, ПНФ и ГДА могут быть особенности иммунопатологических реакций в различных органах и тканях. Показатели ферментативной активности и содержания антител к ферментам гуаниновой ветви ПМ могут использоваться в диагностике ранних клинических проявлений РА и СКВ, а также в качестве дополнительного критерия оценки эффективности проводимой терапии.

• Бакумов П.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой профессиональных болезней с курсом общей врачебной практики (семейная медицина) ФУВ ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Волгоград;
• Бабаева А.Р., д.м.н., профессор, зав. кафедрой факультетской терапии ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Волгоград.

Работа поступила в редакцию 10.09.2012.