Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Распространенность системных ревматических заболеваний, в том числе системной красной волчанки (СКВ) и системной склеродермии (ССД), остается достаточно высокой и отмечается тенденция к ее нарастанию практически во всех возрастных группах.

Известно, что пуриновый обмен, играющий важную роль в поддержании многих функций организма (участие в метаболизме нуклеиновых кислот, регуляции сосудистого тонуса, свертываемости крови и т.д.), участвует в развитии и поддержании хронического воспаления, причем неизбежным следствием длительной тканевой гипоксии является перестройка метаболизма пуринов по катаболическому пути [4]. Иммунологическая картина большинства РЗ характеризуется широким спектром аутоантител, включая антитела к ферментам и антитела к нуклеозидам ДНК. Изменение биохимической и иммунологической активности основных ферментов пуринового метаболизма (ПМ) - пуриннуклеозидфосфорилазы, аденозиндезаминазы и гуаниндезаминазы, - играющих важную роль в организме, отражает нарушения в иммунной системе, а также способствует развитию экстраартикулярных проявлений РЗ.

Учитывая, что как СКВ, так и ССД чаще поражает женщин молодого и среднего возраста, вызывая высокий процент инвалидизации, очень важно правильно и в ранние сроки поставить диагноз. Это не всегда возможно в настоящее время, поэтому изучение патогенетических механизмов болезни, разработка новых диагностических тестов, объективно отражающих активность патологического процесса и позволяющих провести дифференциальную диагностику в группе диффузных заболеваний соединительной ткани, является актуальной задачей современной ревматологии.

Цель исследования: совершенствование методов иммунодиагностики СКВ и ССД с помощью иммобилизированных магнитоуправляемых антигенных наносистем (АНС) на основе пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ, ЕС 2.4.2.1), аденозиндезаминазы (АДА, ЕС 3.5.4.4) и гуаниндезаминазы (ГДА, ЕС 3.5.4.3).

Материалы и методы исследования

Критерии включения больных СКВ и ССД в исследование: возраст 18 лет (включительно) и старше; наличие информированного согласия; наличие у больного диагноза СКВ или ССД, соответствующего диагностическим критериям; срок, прошедший после установления диагноза, - не менее 6 месяцев.

Критерии исключения больных СКВ и ССД из исследования: беременность или лактация; алкогольная и (или) наркотическая зависимость; инфицирование вирусом иммунодефицита человека или возбудителями вирусных гепатитов В и С; наличие злокачественного новообразования любой локализации на момент отбора; тяжелая сопутствующая патология (сахарный диабет 1 или 2 типа, хроническая сердечная недостаточность 3, 4 функционального класса, хроническая почечная недостаточность в терминальной стадии, дыхательная недостаточность 2, 3 степени), требующая активного лечения.

Под наблюдением находилось 60 больных СКВ. Средний возраст больных СКВ составил 36,32 ± 15,27 (М ± SD) лет, средний возраст лиц контрольной группы (30 доноров крови) - 26,0 ± 5,56 лет. Среди больных СКВ преобладали женщины (91,7%), абсолютное большинство составляли лица трудоспособного возраста (90%). Продолжительность СКВ составила 7,97 ± 7,36 лет, возраст дебюта болезни 28,5 ± 13,2 лет.

Активность СКВ оценивалась с помощью индексов SLEDAI (исходный показатель, М ± SD: 8,9 ± 5,7; 95% доверительный интервал для М - 7,5...10,4) и ECLAM (исходный показатель, М ± SD: 5,3 ± 2,8; 95% доверительный интервал для М - 4,6...6,0), а также по критериям, предложенным В.А. Насоновой (1985 г.): низкая - 9, умеренная - 34, высокая - 17 человек. Повреждение (необратимые изменения в состоянии здоровья) измерялось с помощью индекса SLICC/ACR (исходный показатель, М ± SD: 1,9 ± 1,7; 95% доверительный интервал для М - 1,5...2,4). При оценке течения СКВ по критериям В.А. Насоновой были получены следующие результаты: у 2 пациентов имело место острое течение СКВ, у 44 - подострое, у 14 - хроническое.

Под наблюдением находилось 83 больных с достоверным диагнозом ССД, в том числе 81 (97,6%) - женщина и 2 (2,4%) мужчин. Средний возраст больных ССД составил 50,3 ± 11,9 лет, продолжительность заболевания 8,3 ± 7,06 лет. У 49 (59%) больных диагностировано подострое течение процесса, у 28 - хроническое, а у 6 пациентов - острое. I (начальная) стадия болезни выявлена у 11, II стадия (развернутая) - у 63, III поздняя (терминальная) - у 9 пациентов. Согласно индексам активности болезни, разработанным Европейской группой по изучению ССД [6], I степень активности (0-3 балла) диагностирована у 23, II (3,5-6 баллов) - у 46, III (более 6,5) - у 14 человек.

У всех больных определялся модифицированный кожный счет, оцениваемый в баллах (от 0 до 3) в 17 областях тела [5]. Среднее значение кожного счета составило 12,37 ± 7,18 баллов (таблица).

Выраженность кожного счета в зависимости от степени активности болезни

Примечание: М - среднее значение, m - ошибка репрезентативности, SD - стандартное отклонение, Ме - медиана, ДИ - доверительный интервал, IQR - межквартильный размах, n - количество больных.

С целью выявления тяжести течения болезни также определяли степень выраженности висцеральных поражений, используя критерии, предложенные в клинических рекомендациях Ассоциации ревматологов России. Было диагностировано 47 (56,6%) больных с I стадией выраженности, 28 (33,7%) - со II стадией и 8 (9,6%) - с III стадией.

Контрольную группу составили 30 практически здоровых лиц (17 женщин и 13 мужчин в возрасте от 25 до 47 лет).

Антитела к ПНФ (анти-ПНФ), ГДА (анти-ГДА), АДА (анти-АДА) определяли в сыворотке крови по модифицированной методике иммуноферментного анализа (Гонтарь И.П., 2002) с использованием иммобилизированных магнитоуправляемых антигенных наносистем (АНС) на основе соответствующего фермента в качестве антигенной матрицы. В качестве антигена использовались коммерческие препараты ПНФ, АДА и ГДА («Sigma», США). Иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля. Результаты учитывали на многоканальном микропланшетном спектрофотометре при длине волны 450 нм и выражали в единицах оптической плотности (Ед). Результаты считались положительными при превышении в дублированных образцах средних показателей оптической плотности средних значений нормальных сывороток (30 здоровых доноров крови) не менее чем на 2 стандартных отклонения.

Статистический анализ экспериментальных данных выполнялся с помощью программного пакета «STATISTICA 6.0 FOR WINDOWS» (StatSoft Inc., USA). Представление описательных статистик и выбор статистических критериев производились исходя из цели исследования, решаемых задач и рекомендаций руководств по биостатистике. Результат считался достоверным при р < 0,05.

Анти-ПНФ были выявлены у 25 (41,7%) больных СКВ и коррелировали с увеличением индекса SLEDAI (p = 0,012) и активностью ПНФ в сыворотке крови (r = -0,72; p < 0,001). В группе больных СКВ, имеющих повышенные уровни анти-ПНФ, наблюдалось достоверно более частое поражение почек (хи квадрат с поправкой Йетса = 7,34, р = 0,006) и сердечно-сосудистой системы (хи квадрат с поправкой Йетса = 3,78, р = 0,048). Несколько чаще, но статистически незначимо, у больных с наличием анти-ПНФ отмечалось поражение мышц (p = 0,064). Более частое обнаружение анти-ПНФ у больных СКВ с поражением почек, положительная корреляционная связь с величиной протеинурии при этом заболевании, а также положительная динамика уровня анти-ПНФ на фоне терапии могут служить косвенными доказательствами важной роли данных антител в патогенезе нефропатии при СКВ. Наряду с этим, при анализе подгрупп больных СКВ с продолжительностью заболевания менее 1 года анти-ПНФ были обнаружены у 40% (2 из 5) больных.

Антитела к АДА были обнаружены у 22 больных СКВ (36,7%). При анализе зависимостей уровня анти-АДА была выявлена тесная связь с активностью СКВ: коэффициент корреляции с индексами активности SLEDA и ECLAM составил 0,312 (р = 0,017) и 0,328 (р = 0,009), соответственно. Уровень анти-АДА (М ± SD) у больных с умеренной (0,132 ± 0,076) и высокой (0,154 ± 0,082) активностью был значимо выше, чем у больных с низкой активностью СКВ (0,067 ± 0,023). В группе больных СКВ было отмечено, что антитела к фосфолипидам класса IgG чаще и в более высоком титре обнаруживались у анти-АДА-позитивных пациентов, чем у анти-АДА-негативных больных СКВ (c2 = 6,4; р < 0,02). Принимая во внимание, что определенная часть АДА сосредоточена во фракции плазматических мембран эритроцитов и тромбоцитов в виде комплекса с гликопротеидами, представляется вероятным возможность конформационного воздействия анти-АДА на b₂-гликопротеин-I, что способствует экспрессии «скрытых» эпитопов в молекуле b₂-гликопротеин-I и индукции синтеза антифосфолипидных антител.

При СКВ отмечена положительная корреляция уровня анти-ГДА со значениями индекса SLEDAI (r = 0,361) и отрицательная корреляция с биохимической активностью гуаниндезаминазы в сыворотке крови (r = -0,35). Наиболее высокие уровни анти-ГДА отмечались у больных СКВ с поражением печени (р = 0,024) и у больных с выраженным цитопеническим синдромом (р = 0,039).

При ССД повышенные уровни антител к ПНФ, АДА и ГДА были выявлены у 30 (36%), 45 (54,2%) и 44 (53%) человек (соответственно).

При анализе зависимостей уровней изу­чаемых антител была выявлена тесная связь с активностью ССД. В ходе работы были выявлены статистически значимые корреляционные связи между уровнем всех изучаемых антител (кроме анти-АДА) и активностью патологического процесса (р < 0,005). Определение степени активности патологического процесса у больных ССД остается в настоящее время спорным вопросом, окончательно нерешенным. В практическом здравоохранении для определения активности заболевания, как правило, во внимание принимается узкий круг определенных показателей (чаще всего, например, СОЭ и С-реактивный белок), что может способствовать назначению не всегда адекватной терапии. В настоящее время целесообразно комплексно оценивать выраженность поражения при ССД.

Европейской группой по изучению ССД разработаны и предложены критерии активности ССД по балльной системе оценки разных клинических проявлений заболевания. У больных, набравших 0-3 балла устанавливается I степень активности, 3,5-6 баллов - II степень активности, более 6,5 - III. В соответствии с этими критериями I степень активности диагностирована у 23 (27,7%) из наблюдавшихся нами пациентов, II - у 46 (55,4%), III - у 14 (16,9%). При сравнении больных с разной степенью активности, определенной по балльной системе, получены статистически значимые отличия между изучаемыми показателями для анти-ПНФ (между I и II степенями активности, M(SD): 0,11 ± 0,06 и 0,19 ± 0,09, U-test = 242, р = 0,0003; между II и III степенями активности, M(SD): 0,19 ± 0,09 и 0,27 ± 0,06,: U-test = 143, р = 0,002). При сравнении уровней анти-АДА и анти-ГДА в группах больных ССД с разной степенью активности выявлена тенденция к увеличению количества антител по мере нарастания активности патологического процесса, но отличия не были статистически значимыми (рисунок).

Наряду с этим в группе больных ССД, позитивных по анти-ПНФ, статистически значимо чаще выявлялись поражения сердца (χ² с поправкой Йетса = 4,16, р = 0,041), легких (χ² с поправкой Йетса = 3,46, р = 0,049), анемия (χ² с поправкой Йетса = 6,95, р = 0,008), выраженный синдром Рейно (χ² с поправкой Йетса = 8,74, р = 0,004). Было выявлено, что все больные с высоким содержанием антител к ПНФ имели высокую степень синдрома Рейно (II - IV), наличие которого приводит к ишемии и, следовательно, гипоксии тканей [1]. В условиях гипоксии происходит перестройка метаболизма пуринов по катаболическому пути и, как следствие этого, наблюдается накопление пуриновых нуклеозидов и оснований, как в клеточном, так и во внеклеточном пространстве, идет избыточное образование гипоксантина и ксантина, снижается или прекращается синтез АТФ в гепатоцитах. Выраженность происходящих явлений может быть связана и с изменением активности ферментов пуринового метаболизма при ССД, в результате которых происходит усиление пероксидации мембранных структур, апоптоза клеток, что при снижении антиоксидантной защиты, в том числе вследствие образования антител к ферментам, наблюдающейся при системных заболеваниях соединительной ткани, способствует развитию различной висцеральной патологии [3].

В группе больных, позитивных по анти-АДА, статистически значимо чаще выявлялось поражение печени (χ² с поправкой Йетса = 5,47, р = 0,02) и почек (χ² с поправкой Йетса = 2,93, р = 0,09).

В группе больных, позитивных по анти-ГДА, статистически значимо чаще выявлялось поражение печени (χ² с поправкой Йетса = 18,95, р = 0,001) и анемия (χ² с поправкой Йетса = 6,92, р = 0,009).

В нормальных условиях собственные белки приводят к развитию естественной толерантности, так как основные антигенные детерминанты собственных белков распознаются Т-клетками, следовательно, не могут вызвать образование антител. В случае изменения конформации белка на его поверхности появляются «скрытые эпитопы», т.е. те антигенные детерминанты, которые не участвовали в процессе выработки иммунологической толерантности, а значит, распознаются как чужеродные антиге- ны [8]. Конформационные изменения структуры белка могут происходить в результате разных причин, например, изменение биохимических параметров окружающей среды (рН, окисление SH-групп и т.д.). Одной из таких возможных причин могут явиться активные формы кислорода (АФК) и усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ). При диффузных болезнях соединительной ткани имеет место накопление АФК, вторичных свободнорадикальных продуктов, которые активно реагируют с молекулами в ближайшем окружении [7]. В результате этих процессов происходит усиление пероксидации мембранных структур, апоптоза клеток, что при снижении антиокcидантной защиты, наблюдающейся при СКВ и ССД [3], способствует развитию различной висцеральной патологии. Помимо этого, апоптоз, приводящий к усилению секвестрации аутоантигенов в апоптотические тельца, будет способствовать срыву толерантности и увеличению выработки аутоантител.

Иммунные нарушения и изменения биохимических процессов неразрывно связаны. Так, с одной стороны, иммунные комплексы, находясь в кровеносном русле, в различных органах, способствуют развитию воспалительной реакции с привлечением полиморфно-ядерных нейтрофилов. При этом происходит высвобождение большого количества лизосомальных ферментов, коллагеназы, которые оказывают повреждающее действие на протеогликаны, коллаген и другие структурные компоненты соединительной ткани [2]. Дополнительным стимулятором макрофагов также служат лимфокины, высвобождаемые из активированных Т-клеток.

С другой стороны, активация макрофагов способствует гиперпродукции АФК. Чрезмерное образование свободных радикалов, вызывая повреждение мембран макрофагов, эритроцитов и других клеточных структур, способствует выходу в экстрацеллюлярное пространство многих биологически активных веществ, в том числе и ферментов. Наличие антигенных свойств у ферментов обеспечивает ответную реакцию при их выходе из клетки, а воздействие различных факторов воспаления (лизосомальные ферменты, АФК, продукты ПОЛ) усиливает антигенные свойства энзимов, вследствие возможного окисления их функциональных групп.

Таким образом, АФК играют важную роль в эффекторной фазе иммунного ответа и могут способствовать развитию хронического воспалительного процесса. Кроме того, вызывая повреждение различных клеточных и тканевых структур, они способствуют аутоиммунизации организма и тем самым образованию новых иммунных комплексов. Поэтому становится понятной выявленная нами положительная корреляционная связь между активностью болезни и уровнем антителогенеза к изучаемым энзимам.

Внедрение инновационных методов лабораторной диагностики на основе АНС может быть использовано для определения специфических маркеров СКВ и ССД. По изменению иммунологической активности ферментов ПМ можно судить об активности патологического процесса и степени выраженности экстраартикулярных проявлений системных заболеваний. Наличие аутоантител к ферментам ПМ может свидетельствовать о глубине нарушения анаболических и деструктивных процессов у больных СКВ и ССД.

• Зборовский А.Б., д.м.н., профессор кафедры госпитальной терапии ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Волгоград;
• Емельянов Д.Н., д.м.н., профессор, зав. кафедрой пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Волгоград.

Работа поступила в редакцию 14.08.2012.