Хлорофиллы и каротиноиды являются главными фоторецепторами фотосинтезирующей клетки. Их содержание во многом зависит от интенсивности жизнедеятельности организма. Содержание пигментов в растительном организме отражает реакцию на любые изменения во внешней среде и зависит от степени их адаптации к новым экологическим условиям [1]. По содержанию этих пигментов можно оценить не только возрастные, но и генетические особенности растения. Адаптационные возможности ассимиляционного аппарата растений включают как иммобилизацию уже имеющихся приспособительных процессов, так и новые защитные механизмы. Одни из них активируются как ответная реакция на любой стресс, другие (структурные, физиологические и биохимические перестройки) могут быть следствием специфической реакции на тот или иной стресс, которые проявляются в виде различных болезней, как следствие, появление плодовых тел грибов. Способный поражать растения через небольшие поранения ствола, ложный осиновый трутовик, проникая в растительный организм с помощью базидиоспор, влияет на все физиологические и биохимические процессы, начиная с поражаемого органа, затем поражая всё растение [2, 4].
Изучению болезни осины в условиях Ульяновской области уделяется недостаточное внимание с точки зрения развития и вреда от возбудителя. В официальной отчётности по заражённым насаждениям ложным осиновым трутовиком числятся лишь на сотнях га вместо действительных нескольких десятков тысяч га [7].
Чтобы растительный организм был способен вырабатывать различные защитные приспособления к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, необходимо разработать различные пути регуляции данного процесса. Одним из таких путей является изменение содержания пигментов фотосинтеза в зависимости от действия различных повреждающих факторов на растительный организм [6, 9]. В современной практике состав и содержание каротиноидов в растительных тканях определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Однако использование этого метода не всегда оправдано из-за его трудоемкости и высокой стоимости. В ряде случаев, когда нет необходимости определения состава каротиноидов, применяют более простой и дешевый спектрофотометрический метод оценки содержания пигментов в экстрактах тканей без предварительного хроматографического разделения [5, 8]. Спектрометрический метод основан на изменении спектральных особенностей отражения листьев в результате воздействия на растительный организм (дерево) ложным осиновым трутовиком, который хорошо контактирует с физиологическим состоянием растений и позволяет оценить степень их заражённости на ранних стадиях её проявления, при отсутствии видимых признаков угнетения [9]. Приведенные выше сведения позволяют считать актуальным изучение содержания пигментов фотосинтеза под воздействием Phellinus tremulae Bond et Boriss.Материалы и методы исследований
Объектом исследования явились свежие листья осины (Populus tremula L.). Материал был собран в июле 2011 г., в дневное время, в период наибольшей фотосинтетической активности, с осиновых древостоев на территории Новочеремшанского участкового лесничества в наиболее распространённом типе ле- са - осиннике снытьево-ясменниковом.
Для определения содержания пигментов хлорофилла a, b и каротиноидов в составе зелёной биомассы древесной породы осины собирали образцы листьев с трёх частей кроны: с верхней, средней и нижней. Образцы листьев были собраны со здоровых и заражённых осиновых древостоев Phellinus tremulae Bond et Boriss в 6 кратной повторности (для каждой части кроны). Осиновый древостой на момент сбора образцов листьев имел возраст 55 лет.
При исследовании использовали спектрофотометрический метод определения содержания пигментов. Прежде чем определять содержание фотосинтетических пигментов в листьях, необходимо их извлечь, для чего используют метод экстра- гирования.
Из растительного материала получали спиртовые вытяжки. Для этого использовали навеску свежего растительного материала (30 мг) в 6-кратной повторности, которую взвешивали на аналитических весах с точностью до 0,0001 г. Затем растирали в фарфоровой ступке с добавлением диоксида кальция и кварцевого песка и небольшого количества 96%-го этилового спирта (2-3 мл). По завершении растирания для фильтрации при помощи каучуковой пробки и насоса Камского переливали для фильтрации в колбу Бунзена в течение 15 мин. Затем фильтрат из колбы Бунзена переливали в мерную колбу на 25 мл. Оставшуюся навеску вновь заливали 96%-й этанолом и растирали. Эту процедуру повторяли 2-4 раза пока пигменты не были извлечены полностью. После фильтрования доводили объём вытяжки чистым растворителем до 25 мл. Полученная спиртовая вытяжка содержит сумму зелёных и жёлтых пигментов. Оптическую плотность вытяжек определяли на однолучевом автоматизированном спектрофотометре СФ-102. Для количественного определения часть полученного экстракта наливали в кювету спектрофотометра. Вторая кювета заполняется чистым растворителем (96%-м этанолом). Кюветы помещали в кюветные камеры спектрофотометра.
Содержание отдельных пигментов (С) устанавливали с помощью волнового метода, определяя оптическую плотность (D) вытяжек при 665, 649 и 440,5 нм (максимумы поглощения пигментов хлорофилла a, хлорофилла b и каротиноидов). Основной расчёт концентрации пигментов хлорофилла a, и b и каротиноидов (С) проводился по формулам Смита и Бенитеза [10] для 96%-го этилового спирта [9].
Сa (мг/л) = 13,70∙D665 - 5,76∙D649; (1)
Сb(мг/л) = 25,80∙D649 - 7,60∙D665; (2)
Сa+ b(мг/л) = 6,10∙D665 +20,04∙D649; (3)
Скар(мг/л) = 4,69∙D440,5 - 0,268 Сa+ b. (4)
Содержание пигментов в растительном материале в мг/г сырого веса рассчитывали по формуле
(5)
где С - концентрация пигмента в мг/л (после расчёта по формулам (1), (2), (3), (4)); V - объем вытяжки пигмента в мл; Р - навеска растительного материала в г; А - содержание пигмента в растительном материале в мг на 1 г сырого веса.
Результаты исследований и их обсуждение
Представлен анализ содержания хлорофиллов a, b и каротиноидов в листьях осины здоровых древостоев и заражённых Phellinus tremulae Bond et Boriss (табл. 1, 2.; рис. 1, 2).
Как видно из табл. 1, максимальное содержание хлорофиллов a b и каротиноидов отмечается в листьях верхней части кроны (в среднем 0,77; 0,32; 0,17 мг/г), что объясняется более лучшей освещённостью кроны. Значительно меньшее содержание хлорофиллов и каротиноидов обнаружено в нижней части кроны, (соответственно 0,64; 0,28; 0,21 мг/г), что объясняется достаточно низким расположением листьев по отношению к солнцу. Содержание хлорофиллов a b и каротиноидов в среднем составило 0,71; 0,29; 0,19 мг/г, что обусловлено равномерным распределением солнечного излучения по кронам.
Таблица 1 Содержание пигментов хлорофиллов и каротиноидов в листьях осины здоровых древостоев
|
Части кроны |
Номер опыта |
Хлорофилл, мг/г () |
Каротиноиды, мг/г () |
|||
|
a |
b |
a + b |
a/b |
|||
|
Верхняя |
1 |
0,77 |
0,32 |
1,09 |
2,40 |
0,17 |
|
2 |
0,78 |
0,33 |
1,11 |
2,37 |
0,17 |
|
|
3 |
0,78 |
0,33 |
1,11 |
2,37 |
0,18 |
|
|
4 |
0,77 |
0,32 |
1,09 |
2,40 |
0,18 |
|
|
5 |
0,78 |
0,33 |
1,11 |
2,37 |
0,17 |
|
|
6 |
0,78 |
0,33 |
1,11 |
2,37 |
0,17 |
|
|
Среднее |
0,77 ± 0,005 |
0,32 ± 0,004 |
1,10 |
2,38 |
0,17 ± 0,003 |
|
|
Средняя |
1 |
0,73 |
0,30 |
1,03 |
2,43 |
0,21 |
|
2 |
0,73 |
0,30 |
1,03 |
2,43 |
0,19 |
|
|
3 |
0,70 |
0,29 |
0,99 |
2,41 |
0,19 |
|
|
4 |
0,72 |
0,30 |
1,02 |
2,40 |
0,19 |
|
|
|
5 |
0,73 |
0,30 |
1,03 |
2,43 |
0,20 |
|
6 |
0,73 |
0,30 |
1,03 |
2,43 |
0,20 |
|
|
Среднее |
0,72 ± 0,011 |
0,29 ± 0,003 |
1,02 |
2,42 |
0,19 ± 0,007 |
|
|
Нижняя |
1 |
0,64 |
0,27 |
0,91 |
2,37 |
0,22 |
|
2 |
0,65 |
0,29 |
0,94 |
2,24 |
0,20 |
|
|
3 |
0,65 |
0,29 |
0,94 |
2,24 |
0,20 |
|
|
4 |
0,64 |
0,27 |
0,91 |
2,37 |
0,22 |
|
|
5 |
0,64 |
0,27 |
0,91 |
2,37 |
0,22 |
|
|
6 |
0,65 |
0,29 |
0,94 |
2,24 |
0,20 |
|
|
Среднее |
0,64 ± 0,005 |
0,28 ± 0,01 |
0,92 |
2,30 |
0,21 ± 0,01 |
|
|
Среднее по трём частям кроны |
0,71 |
0,29 |
1,01 |
2,36 |
0,19 |
|
Рис. 1. Содержание пигментов в листьях здоровых осиновых древостоев в зависимости от части кроны
Результаты исследований содержания пигментов хлорофиллов и каротиноидов в листьях осины заражённых древостоев ложным осиновым трутовиком представлены в табл. 2 и на рис. 2.
Анализ экспериментальных данных по содержанию пигментов в листьях осиновых древостоев, заражённых ложным осиновым трутовиком (см. табл. 2), показывает, что происходит снижение содержания хлорофиллов и увеличение содержания каротиноидов. Листья из нижней части кроны уступают по содержанию хлорофиллов в средней части кроны (в среднем на 0,03; 0,03 мг/г) и в верхней части кроны (на 0,05; 0,06 мг/г, соответственно). Содержание каротиноидов в листьях увеличивается от верхней части кроны к нижней (0,19; 0,21; 0,28 мг/г). Пониженное содержание хлорофиллов в листьях объясняется, вероятно, общим снижением жизнеспособности древесного растения при поражении возбудителем болезни, в результате чего происходит структурно-функциональная, физиолого-биохимическая перестройка организма, что в итоге приводит к снижению фотосинтетической активности растения.
Таблица 2 Содержание пигментов хлоропластов и каротиноидов в листьях осины заражённых древостоев Phellinus tremulae Bond et Boriss
|
Части кроны |
Номер опыта |
Хлорофилл, мг/г () |
Каротиноиды, мг/г () |
|||
|
a |
b |
a+b |
a/b |
|||
|
Верхняя |
1 |
0,47 |
0,29 |
0,86 |
1,96 |
0,19 |
|
2 |
0,47 |
0,27 |
0,79 |
1,92 |
0,20 |
|
|
3 |
0,49 |
0,29 |
0,88 |
2,0 |
0,21 |
|
|
4 |
0,50 |
0,30 |
0,90 |
2,0 |
0,21 |
|
|
|
5 |
0,49 |
0,30 |
0,89 |
1,96 |
0,18 |
|
6 |
0,50 |
0,27 |
0,85 |
2,0 |
0,18 |
|
|
Среднее |
0,48 ± 0,02 |
0,28 ± 0,01 |
0,86 |
1,97 |
0,19 ± 0,01 |
|
|
Средняя |
1 |
0,47 |
0,26 |
0,74 |
1,84 |
0,22 |
|
2 |
0,46 |
0,26 |
0,74 |
1,84 |
0,22 |
|
|
3 |
0,46 |
0,25 |
0,73 |
1,92 |
0,20 |
|
|
4 |
0,46 |
0,25 |
0,72 |
1,88 |
0,21 |
|
|
5 |
0,47 |
0,25 |
0,73 |
1,92 |
0,22 |
|
|
|
6 |
0,46 |
0,24 |
0,71 |
1,95 |
0,22 |
|
Среднее |
0,46 ± 0,004 |
0,25 ± 0,006 |
0,72 |
1,89 |
0,21 ± 0,007 |
|
|
Нижняя |
1 |
0,43 |
0,22 |
0,65 |
1,95 |
0,27 |
|
2 |
0,43 |
0,23 |
0,66 |
1,86 |
0,28 |
|
|
3 |
0,42 |
0,22 |
0,64 |
1,90 |
0,30 |
|
|
4 |
0,43 |
0,22 |
0,65 |
2,0 |
0,29 |
|
|
5 |
0,44 |
0,22 |
0,65 |
2,0 |
0,29 |
|
|
6 |
0,44 |
0,22 |
0,65 |
2,0 |
0,27 |
|
|
Среднее |
0,43 ± 0,006 |
0,22 ± 0,003 |
0,65 |
1,39 |
0,28 ± 0,011 |
|
|
Среднее по трём частям кроны |
0,45 |
0,25 |
0,74 |
1,94 |
0,23 |
|
Рис. 2. Содержание пигментов в листьях заражённых осиновых древостоев ложным осиновым трутовиком в зависимости от части кроны
Вследствие заражения осинников грибом происходит уменьшение содержания хлорофилла a (0,48-0,43), хлорофилла b (0,28-0,22) и увеличение каротиноидов (0,19-0,28). Это объясняется тем, что каротиноиды являются наиболее распространённым метаболитом живых организмов, участвующих в системе защиты клеток от воздействия факторов внешней среды [6].
Что касается влияния ложного осинового трутовика на содержание пигментов в листьях осиновых древостоев, то для установления этого влияния провели однофакторный дисперсионный анализ. В процессе анализа установили, что существует связь между содержанием пигментов в организме растения и ложным осиновым трутовиком: по хлорофиллу a это связь выражается Fрасч 26,0 > Fтеор 4,96, при α = 0,05, n1 = 3, n2 = 6; по хлорофиллу b Fрасч 19,8 > Fтеор 4,96, при α = 0,05, n1 = 3, n2 = 6; по каротиноидам Fрасч 10,4 > Fтеор 4,96, при α = 0,05, n1 = 3, n2 = 6). Таким образом, действие патогенна на растительный организм проявляется по разному, с одной стороны - содержание зелёных пигментов уменьшается, а с другой содержание каротиноидов увеличивается.
Выводы
-
Содержание зелёных пигментов как в здоровых осиновых древостоях, так и в заражённых трутовиком уменьшается от верхней части кроны к нижней.
-
Поражение древостоев осиновым трутовиком приводит к уменьшению содержания хлорофиллов и увеличению каротиноидов в листьях осины во всех частях кроны.
Рецензенты:
-
Благовещенская Н.В., д.б.н., доцент, директор Ульяновского областного экологического центра, г. Ульяновск;
-
Костин В.И., д.с.-х.н., профессор, заведующий кафедрой биологии, химии, ТХППР ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», г. Ульяновск.
Работа поступила в редакцию 03.08.2012.