Изучение прогностического значения маркеров апоптоза, и в том числе к экспрессии ингибитора апоптоза bcl-2 при почечно-клеточном раке (ПКР), актуально на протяжении последних десятилетий. Не ослабевают усилия исследователей по поиску взаимосвязей между экспрессией bcl-2, традиционными классическими факторами прогноза и отдаленными результатами после хирургического лечения ПКР.
Так, в ряде работ была изучена взаимосвязь экспрессии bcl-2 и степенью анаплазии ПКР. Zhang X. и соавт. (2000) обнаружили взаимосвязь между bcl-2 и градацией опухоли. По данным Гуторова С.Л. и соавт. (2007), при отсутствии экспрессии bcl-2 отмечалась тенденция к возрастанию степени анаплазии опухоли. Hindermann W. и соавт. (1997) показали, что для карциномы почки степени анаплазии G1 были характерны более высокие значения bcl-2, чем степеней G2-3. Этими авторами сделан вывод, что прогрессия рака почки от высокодифференцированного к низкодифференцированному сопровождалась уменьшением экспрессии bcl-2. Аналогичные данные получили и другие исследователи [5]. В то же время Vasavada S.P. и соавт. (1998) не нашли ассоциации между экспрессией bcl-2 и градацией опухоли.
Исследованию взаимосвязи между активностью bcl-2 и клинической стадией заболевания посвящены немногочисленные работы. Oudard S. и соавт. (2002) обнаружили взаимосвязь высокой активности bcl-2 и низкой стадии. Сходные данные получили и другие авторы [5]. Однако некоторые авторы не обнаружили взаимосвязи экспрессии bcl-2 с клинической стадией [12].
По данным некоторых авторов экспрессия bcl-2 была взаимосвязана с гистологическим вариантом опухоли [13]. Paraf F. и соавт. (1995) показали, что большинство светлоклеточных карцином было отрицательно на данный маркер или в них содержались редкие положительные клетки, а все папиллярные карциномы были положительны для bcl-2. Другие авторы не обнаружили корреляции маркера с гистологическим типом опухоли [14]. Так, не было существенного увеличения иммунореактивности белка bcl-2 в саркоматоидных компонентах опухолей, по сравнению с другими компонентами [7].
Имеется небольшое количество работ, посвященных изучению bcl-2 в первичных опухолях при метастазировании. По данным Лоран О.Б. и соавт. (2008), как для местно-распространенного, так и метастатического РП не были характерны высокие уровни белка bcl-2. Аналогичные данные получил Шустицкий Н.А. (2007). Другие авторы также не обнаружили взаимосвязи между экспрессией bcl-2 и возникновением метастазов [15].
В ряде работ была выявлена взаимосвязь между экспрессией bcl-2 и послеоперационным выживанием больных [5, 9], но имеются также работы, в которых данной взаимосвязи обнаружено не было [6, 14, 15].
Таким образом, несмотря на обилие работ по изучению прогностического значения ингибитора апоптоза bcl-2 при ПКР, полученные авторами данные противоречивы и поэтому значение экспрессии данного онкопротеина при прогнозе РП нуждается в дальнейшем изучении.
Целью данной работы стало выявление иммуногистохимической экспрессии ингибитора апоптоза bcl-2 при ПКР и поиск взаимосвязей активности маркера с важнейшими клинико-анатомическими факторами прогноза и послеоперационной выживаемостью пациентов.
Материал и методы исследования
Изучен операционный материал 63 больных ПКР. Средний возраст пациентов составил 56,7 ± 1,3 года. Мужчин было 33 (52,4%), женщин - 30 (47,6%). По гистологическому строению опухоли были представлены следующим образом: светлоклеточный рак - 37; зернистоклеточный рак - 3; папиллярный рак - 15; хромофобный рак - 2; веретеноклеточный (саркоматоидный) рак - 2 и нейроэндокринный рак - 4.
При группировке опухолей по клиническим стадиям (Ι-ΙV) было выделено: Ι стадии (T1N0M0) соответствовали 35 (55,5%) наблюдений; ΙΙ стадии (T2N0M0) 5 (7,9%) наблюдений; ΙΙΙ стадии (T1N1M0, T2N1M0, T3N0M0, T3N1M0) - 13 (20,6%) и ΙV стадии (T4N0M0, T4N1M0, TлюбаяN2M1, TлюбаяNлюбаяM1) - 10 (16%). Степень злокачественности оценивали по Fuhrman S.A. и соавт (1982). Изученный материал включал 17 (27%) опухолей степени анаплазии G1; 15 (23,8%) опухолей степени анаплазии G2; 8 (12,7%) степени анаплазии G3 и 23 (36,5%) ‒ степени G4.
Метастатических карцином было 16, опухолей без метастазов - 47. Средний размер опухолевого узла составил - 7,1 ± 0,4 см.
Материал фиксировали в 10%-ном нейтральном забуференном формалине на протяжении 12-24 часов. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином, на коллаген ‒ по ван Гизон и кислые мукополисахариды коллоидным железом ‒ по Гале. Нейроэндокринный фенотип карцином выявляли иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител к хромогранину А и синаптофизину.
Уровень экспрессии молекулярно-биологического маркера Bcl-2 (клон 124, «DAKO» определяли при помощи иммуногистохимического метода по рекомендованным производителями протоколам. При оценке иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания bcl-2 использовали полуколичественный метод: 0 баллов - отсутствие окрашивания; + (1 балл) - более 20% клеток со слабой интенсивностью окрашивания цитоплазмы; ++ (2 балла) - умеренное окрашивание цитоплазмы; +++ (3 балла) - более 20% с интенсивным окрашиванием цитоплазмы; ++++ (4 балла) - интенсивное окрашивание цитоплазмы более чем 80% клеток. В тех случаях, когда интенсивность окрашивания варьировала, например от + (1 балл) до ++ (2 балла), получали среднее - 1,5 балла.
Сведения о выживаемости больных получали по данным канцер-регистра и амбулаторных карт.
Статистическую обработку материала проводили при помощи статистического пакета Statistica 6.0. При нормальном распределении данных при проверке статистических гипотез применяли методы параметрической статистики (t-test Стьюдента), а если полученные данные не соответствовали критериям нормального распределения (критерий Шапиро-Уилка W = 0,89, p < 0,01), то применяли тест Колмогоро- ва-Смирнова или U-тест Манна-Уитни. Данные считали достоверными при р < 0,05. Построение кривых выживаемости проводили по методу Kaplan-Meier, достоверность различий показателей оценивали с помощью log-rank теста.
Результаты исследования и их обсуждение
Среди всех исследованных больных, вне зависимости от пола, возраста, варианта ПКР и т.д. разброс значений экспрессии онкопротеина bcl-2 был от 0 до 4 баллов. Выявление экспрессии ингибитора апоптоза bcl-2 было представлено мелкосетчатым, зернистым или диффузным коричневым окрашиванием цитоплазмы опухолевых клеток.
В целом среднее значение индекса bcl-2 во всей группе составило 1,7 ± 0,2 баллов, что, по нашему мнению, не является высоким значением. Низкий уровень ингибиции апоптоза был обнаружен в 44 опухолях (69,8%), а высокий ‒ в 19 (30,2%). При высоком уровне ингибиции апоптоза показатель bcl-2 в среднем составил 3,4 ± 0,1 балла. При низком уровне ингибиции апоптоза показатель был равен 0,95 ± 0,1 балла.
При сопоставлении выраженности экспрессии bcl-2 c классическими прогностическими клинико-анатомическими факторами при РП были выявлены некоторые взаимосвязи.
Корреляционный анализ выявил взаимосвязи между bcl-2 и клинической стадией (r = 0,30; p = 0,02), размером опухолевого узла (r = 0,29; p = 0,02), наличием регионарных и дистантных метастазов (r = 0,35; p = 0,005), гистологическим вариантом опухоли (r = 0,37; p = 0,003). Не было обнаружено взаимосвязи с полом (r = 0,15; p = 0,22), возрастом (r = 0,16; r = 0,22) больных и градацией опухоли по Фурману (r = 0,18; p = 0,15).
Среднее значение bcl-2 у мужчин составило 1,7 ± 0,2 балла, а у женщин возрастало до 2,0 ± 0,3 балла (p = 0,35).
В зависимости от возраста средние показатели экспрессии bcl-2 составили: у больных в возрасте от 40 до 49 лет - 1,6 ± 0,3 балла, от 50 до 59 лет - 1,45 ± 0,3 балла, от 60 до 69 лет - 1,7 ± 0,3 балла и от 70 до 79 лет - 2,8 ± 0,4 балла. Таким образом, наиболее высокие показатели индекса маркера bcl-2 наблюдали в возрастной группе больных от 70 до 75 лет, а самые низкие ‒ в группе от 50 до 59 лет.
У пациентов с I клинической стадией заболевания среднее значение экспрессии bcl-2 составило 2,0 ± 0,2 балла, со II стадией - 2,0 ± 0,2 балла, с III стадией - 1,2 ± 0,4 балла и с IV стадией - 1,2 ± 0,3 балла. Таким образом, отмечается уменьшение экспрессии онкопротеина по мере увеличения клинической стадии патологического процесса.
В зависимости от гистологического типа ПКР наименьшее среднее значение экспрессии bcl-2 было обнаружено при светлоклеточном (1,0 ± 0,2 балла) и нейроэндокринном раках (1,5 ± 0,6 баллов). Промежуточное положение занимали хромофобный (2,0 балла), веретеноклеточный (2,5 ± 0,3 балла) и зернистоклеточный раки (2,7 ± 0,3 балла). Наибольшие показатели bcl-2 были отмечены при папиллярной карциноме (3,1 ± 0,3 балла) (табл. 1)
С увеличением степени ядерной атипии по Фурману обнаруживали тенденцию к уменьшению экспрессии bcl-2: при GI экспрессия составила 2,1 ± 0,3 балла, при GII ‒ 2,1 ± 0,4 балла, при GIII ‒ 1,4 ± 0,6 балла и при GIV ‒ 1,6 ± 0,3 балла.
При величине опухолевого узла < 7,0 см экспрессия маркера была 2,0 ± 0,2 балла, а при увеличении размера ≥ 7,0 см - 1,2 ± 0,2 балла.
У больных без регионарных и отдаленных метастазов экспрессия bcl-2 составила 2,0 ± 0,2 балла, а при наличии метастазов она достоверно снижалась до 0,9 ± 0,2 балла (p = 0,007) (табл. 2)
Таблица 1 Экспрессия bcl-2 в зависимости от гистологического варианта рака почки
|
Гистологический вариант ПКР |
Экспрессия bcl-2 (баллы) |
|
Светлоклеточный рак |
1,0 ± 0,2* |
|
Нейроэндокринный рак |
1,5 ± 0,6 |
|
Хромофобный рак |
2,0 |
|
Веретенноклеточный рак |
2,5 ± 0,3 |
|
Гранулярноклеточный рак |
2,7 ± 0,3* |
|
Папиллярный рак |
3,1 ± 0,3* |
Примечание: * - p < 0,05.
Таблица 2 Экспрессия bcl-2 в зависимости от наличия регионарных и отдаленных метастазов
|
Отдаленные и регионарные метастазы |
Экспрессия bcl-2 (баллы) |
|
Без метастазов |
2,0 ± 0,2* |
|
С метастазами |
0,9 ± 0,2* |
Примечание: * - p < 0,05.
Из 63 пациентов выживаемость в течение 5 лет удалось проследить у 32 (50,8%) больных. Анализ выживаемости по Каплан-Мейеру в зависимости от уровня экспрессии онкопротеина bcl-2 показал, что когда экспрессия ингибитора апоптоза bcl-2 была 3 и более баллов, то кумулятивная доля выживших к 1800 дню составила 0,92, а когда 2 и менее балла, тогда ни один пациент не дожил до 5 лет (рисунок).
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что, в целом, характерны низкие показатели экспрессии ингибитора апоптоза bcl-2. Экспрессия bcl-2 была взаимосвязана с рядом важных прогностических клинико-анатомических факторов и поэтому может быть использована в качестве дополнительного фактора прогноза. Отсутствие экспрессии bcl-2 в клетках опухоли можно рассматривать в качестве критерия вероятного возникновения метастазов опухоли. Выявлена взаимосвязь величины экспрессии маркера и общей выживаемости больных. Низкий уровень значения изученного онкопротеина - неблагоприятный фактор в предсказании выживаемости больных.
Кумулятивная пропорция 5-летней выживаемости больных ПКР в зависимости от экспрессии bcl-2 в опухоли
Рецензенты:
-
Высоцкий Ю.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой нормальной анатомии человека ГБОУ ВПО АГМУ, г. Барнаул;
-
Лепилов А.В., д.м.н., профессор кафедры патологической анатомии с секционным курсом ГБОУ ВПО АГМУ, г. Барнаул.
Работа поступила в редакцию 28.06.2012.