На фоне продолжающегося демографического кризиса в России одной из актуальных проблем на сегодняшний день остается воспроизводство здорового потомства. В настоящее время отмечается увеличение числа женщин фертильного возраста с различными экстрагенитальными заболеваниями, среди которых особое место занимают болезни гепатобилиарной системы, в том числе хронические гепатиты, распространенность которых в мире год от года возрастает. Многочисленные экспериментальные и клинические исследования указывают на нарушение становления систем жизнеобеспечения у потомства матерей с хронической патологией гепатобилиарной системы, в том числе репродуктивной, иммунной, макрофагальной, пищеварительной и др. [1, 2].
Вместе с тем, является постулатом тот факт, что для функционирования всех без исключения систем органов необходимо их достаточное и полноценное кровоснабжение. Выполнение же кровью важнейших функций, а именно интегративной, транспортной, трофической, дыхательной, защитной, иммунной, в известной мере зависит от нормального протекания гемопоэза в красном костном мозге. Нарушение протекания нейтрофилоцитопоэза ведет к снижению и потере неспецифической резистентности организма [1].
В то же время, способность любой клетки адекватно ситуации выполнять свои функции напрямую зависит от достаточного получения этой клеткой питательных веществ и энергии. Наличие запаса питательных веществ определяет способность клетки при действии каких-либо раздражителей увеличивать свою активность, адекватно отвечая на стимуляцию [9]. Отмеченное выше предопределило выбор темы и цель исследования.
Целью настоящего исследования явился анализ роли хронического поражения печени матери в нарушении становления способности к накоплению питательного субстрата нейтрофилами красного костного мозга потомства.
Материал и методы исследования
В качестве объекта исследования в эксперименте были использованы белые лабораторные крысы (самки) «Вистар», всего 168 животных, в том числе взрослые самки (36 животных) и их разнополое потомст- во - 142 животных из 36 пометов в различные сроки постнатального периода (15-е, 30-е, 45-е, 60-е сутки). Сроки исследования согласуются с общепризнанным подразделением возрастных периодов у данной группы животных [5].
Исходя из цели настоящего исследования, все экспериментальные животные были разделены на 3 группы. Первую группу составили животные от интактных матерей - контрольная группа - 46 животных из 11 пометов. Во вторую группу вошло потомство от самок с хроническим экспериментальным поражением печени с помощью D(+)-галактозами- на - первая экспериментальная группа - 48 животных из 13 пометов. В третью группу вошло потомство самок с хроническим экспериментальным поражением печени с помощью фильтрата E. coli - вторая экспериментальная группа - 48 животных из 12 помётов.
Исследования проводились с учетом суточных и сезонных колебаний. Работа с экспериментальными животными проводилась в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» [5].
Модель хронического поражения печени путем введения D(+)-галактозамина. Поражение печени моделировалось путем внутрибрюшинного введения гепатотропного яда D(+)-галактозамина гидрохлорида (Sigma-G0500, США) на 0,9% растворе натрия хлорида в дозе 250 мг/кг массы тела животного. Экспериментальный гепатит, вызываемый введением D(+)-галактозамина, по своим морфологическим, иммунологическим и биохимическим характеристикам рассматривается рядом исследователей как адекватная модель вирусного гепатита В у человека [3].
Модель хронического поражения печени путем введения фильтрата E. coli.
Поражение печени моделировалось путем введения половозрелому животному (самке) в три участка печени - по одной инъекции с обеих сторон у основания мечевидного отростка и справа у края реберной дуги по срединно-ключичной линии - 0,2 мл фильтрата шестидневной культуры E. coli (штамм АТСС 25922) в разведении 1:4. Разрешающую инъекцию производили через 24 часа путём введения в хвостовую вену фильтрата шестидневной культуры E. coli из расчёта 0,3 мл/кг массы тела. По данным литературы, экспериментальный гепатит, вызываемый введением фильтрата шестидневной культуры E. coli, по своим морфологическим, иммунологическим и биохимическим характеристикам рассматривается как адекватная модель вирусного гепатита А у человека [8].
Хронические поражения печени верифицировали у лабораторных животных с помощью морфологических, биохимических и иммунологических методов [4, 9].
Морфологические и гистохимические методы исследования. Красный костный мозг получали из отпрепарированной от мышц бедренной кости забитого животного с отсеченными эпифизами путем нагнетания 0,9% раствора натрия хлорида с использованием шприца на 2 мл. Из полученного из бедренной кости костного мозга изготавливали мазки [4].
В мазках изучалась способность клеток к накоплению универсального питательного субстрата животной клетки - гликогена. С этой целью проводилась ШИК-реакция по Мак-Манусу, представляющая собой выявление гликогена методом Шифф-йодная кислота. Реакция основана на способности йодной кислоты окислять спиртовые группы, что при условии взаимодействия с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота) приводит к образованию кислото-стойкого красителя красно-фиолетового цвета.
ШИК-положительные вещества окрашиваются в красный цвет различных оттенков. Нейтральные мукополисахариды, содержащие гексозу, - пурпурно-красные, гликоген - темно-красный [4, 9].
Кроме того, количество накопленного клетками гликогена визуально оценивали полуколичественным методом с вычислением среднего гистохимического показателя (СГП) Астальди и Верга (1957) по формуле
СГП = (0·а + 1·б + 2·в + 3·г)/100,
где 0 - отсутствие гранул в клетке; 1 - гранулами занято < 25% площади цитоплазмы; 2 - гранулами занято 25-50% площади цитоплазмы; 3 - гранулами занято > 50% площади цитоплазмы.
Статистические методы исследования. Статистический анализ полученных данных проводили с использованием лицензионного пакета прикладных программ «SPSS 17.0». При сравнительном анализе данных использовали непараметрический критерий Манна-Уитни [7].
Результаты исследования и их обсуждение
Способность к накоплению гранул гликогена оценивалась на 15, 30, 45 и 60 день постнатального онтогенеза у нейтрофилов на различных стадиях развития. Из клеток митотического пула были рассмотрены миелобласты, миелоциты и метамиелоциты. Результаты исследования миелобластов контрольных и подопытных животных представлены в табл. 1. Отражена доля содержащих гранулы гликогена клеток от общего количества миелобластов.
Из табл. 1 видно, что количество накапливающих гликоген миелобластов на раннем сроке постнатального развития (на 15 день) в контроле и обеих опытных группах различается незначительно. С увеличением возраста животных увеличиваются и различия - на 30, 45 и 60 день количество содержащих гранулярный гликоген миелобластов в обеих опытных группах существенно ниже по сравнению с контролем.
Результаты оценки содержания гликогена в промиелоцитах представлены в табл. 2. Из табл. 2 следует, что для промиелоцитов сохраняется та же тенденция, что и для миелобластов: незначительные на раннем сроке постнатального онтогенеза различия с возрастом начинают усиливаться. Доля гликогенсодержащих промиелоцитов на 30, 45 и 60 день развития существенно ниже в обеих опытных группах по сравнению с контролем.
Таблица 1 Содержание гликогенсодержащих миелобластов в костном мозге экспериментальных животных (%)
|
Группа
Возраст, сутки |
Контрольная |
Опытная группа 1 |
Опытная группа 2 |
|
15 |
10,64 ± 0,38 |
11,37 ± 0,86 |
9,94 ± 0,64 |
|
30 |
16,65 ± 0,49 |
11,89 ± 0,56* |
14,33 ± 0,56* |
|
45 |
21,32 ± 0,54 |
17,45 ± 0,73* |
18,46 ± 0,31* |
|
60 |
14,47 ± 0,65 |
12,29 ± 0,34 |
11,59 ± 0,67* |
Примечание. * Различия статистически достоверны (р < 0,05).
Таблица 2 Содержание гликогенсодержащих промиелоцитов в костном мозге экспериментальных животных (%)
|
Группа
Возраст, сутки |
Контрольная |
Опытная группа 1 |
Опытная группа 2 |
|
15 |
15,52 ± 0,44 |
15,24 ± 0,63 |
14,67 ± 0,73 |
|
30 |
19,94 ± 0,26 |
17,74 ± 0,62* |
16,65 ± 0,44* |
|
45 |
23,35 ± 0,61 |
20,55 ± 0,27* |
19,78 ± 0,66* |
|
60 |
19,21 ± 0,37 |
17,35 ± 0,54* |
17,01 ± 0,52* |
Примечание. * Различия статистически достоверны (р < 0,05).
Доля содержащих гранулы гликогена миелоцитов у подопытных и интактных крысят представлена в табл. 3. Среди миелоцитов количество гликогенсодержащих клеток на всех сроках развития снижено по сравнению с контролем. С возрастом различия в количестве накапливающих гликоген клеток у подопытных и контрольных крысят увеличиваются. Миелобласты, промиелоциты и миелоциты относятся к митотическому пулу предшественников нейтрофила. Эти клетки активно делятся, практически не несут другой функциональной нагрузки и не обладают характерной для нейтрофила синтетической и фагоцитарной активностью [6]. В связи с этим, эти клетки не остро нуждаются в накоплении питательных веществ. Однако даже на ранних стадиях нейтрофилоцитопоэза наблюдается снижение по сравнению с контролем количества гликогенсодержащих клеток в первой и второй опытных группах, причём по мере созревания клеток от миелобласта к миелоциту различия становятся всё более явными.
Таблица 3 Содержание гликогенсодержащих миелоцитов в костном мозге экспериментальных животных (%)
|
Группа
Возраст, сутки |
Контрольная |
Опытная группа 1 |
Опытная группа 2 |
|
15 |
17,53 ± 0,28 |
15,81 ± 0,33* |
15,38 ± 0,27* |
|
30 |
20,25 ± 0,31 |
18,11 ± 0,49* |
17,73 ± 0,39* |
|
45 |
22,48 ± 0,44 |
19,97 ± 0,35* |
20,18 ± 0,67 |
|
60 |
20,64 ± 0,35 |
18,64 ± 0,37* |
18,52 ± 0,25* |
Примечание. * Различия статистически достоверны (р < 0,05).
Эти результаты позволяют констатировать, что нарушение процессов синтеза и накопления гликогена в нейтрофильных предшественниках начинается на ранних стадиях нейтрофилоцитопоэза [6].
Три следующие стадии развития нейтрофила представляют собой немитотический пул нейтрофильных предшественников. Начиная с метамиелоцитаб начинается собственно процесс дифференцировки - синтез специфических ферментов, накопление оксифильной и азурофильной зернистости, становление фагоцитарной активности, повышение интенсивности окислительно-восстановительных процессов. Клетки способны участвовать в реакциях воспаления и адекватно отвечать на внешний стимул усилением интенсивности метаболизма [6].
В табл. 4 представлены данные по содержанию гликогена в метамиелоцитах крысят контрольной и опытных групп.
Таблица 4 Содержание гликогенсодержащих метамиелоцитов в костном мозге экспериментальных животных (%)
|
Группа
Возраст, сутки |
Контрольная |
Опытная группа 1 |
Опытная группа 2 |
|
15 |
38,61 ± 0,36 |
33,81 ± 0,47* |
35,05 ± 0,43* |
|
30 |
41,67 ± 0,24 |
34,56 ± 0,58* |
34,93 ± 0,55* |
|
45 |
45,30 ± 0,51 |
33,68 ± 0,23* |
35,51 ± 0,38* |
|
60 |
43,59 ± 0,45 |
35,21 ± 0,36* |
37,64 ± 0,17* |
Примечание. * Различия статистически достоверны (р < 0,05).
Согласно таблице, доля содержащих гранулы гликогена метамиелоцитов в обеих опытных группах существенно ниже по сравнению с контролем на всех представленных сроках постнатального развития. Доля содержащих гликоген клеток среди палочкоядерных нейтрофилов контрольных и подопытных животных представлена в табл. 5. Доля содержащих включения гликогена нейтрофилов в обеих опытных группах существенно снижена по сравнению с контролем. Можно отметить, что разница между контролем и опытом по мере повышения степени дифференцировки клеток усиливается.
Таблица 5 Содержание гликогенсодержащих палочкоядерных нейтрофилов в костном мозге экспериментальных животных (%)
|
Группа
Возраст, сутки |
Контрольная |
Опытная группа 1 |
Опытная группа 2 |
|
15 |
64,33 ± 0,21 |
55,78 ± 0,38* |
56,74 ± 0,35* |
|
30 |
70,13 ± 0,53 |
54,86 ± 0,34* |
57,89 ± 0,18* |
|
45 |
71,54 ± 0,37 |
60,72 ± 0,56* |
61,34 ± 0,57* |
|
60 |
68,46 ± 0,52 |
55,26 ± 0,54* |
60,61 ± 0,64* |
Примечание. * Различия статистически достоверны (?р < 0,05).
Наконец, результаты оценки доли гликогенсодержащих зрелых сегментоядерных нейтрофилов представлены в табл. 6. Содержание зрелых нейтрофилов с включениями гликогена в обеих опытных группах достоверно снижено на всех сроках постнатального онтогенеза по сравнению с контролем.
Таблица 6 Содержание гликогенсодержащих сегментоядерных нейтрофилов в костном мозге экспериментальных животных (%)
|
Группа
Возраст, сутки |
Контрольная |
Опытная группа 1 |
Опытная группа 2 |
|
15 |
71,42 ± 0,43 |
63,37 ± 0,19* |
61,28 ± 0,26* |
|
30 |
73,46 ± 0,61 |
65,44 ± 0,51* |
64,32 ± 0,37* |
|
45 |
70,45 ± 0,34 |
62,45 ± 0,31* |
61,86 ± 0,64* |
|
60 |
71,67 ± 0,39 |
61,34 ± 0,27* |
62,35 ± 0,43* |
Примечание. * Различия статистически достоверны (р < 0,05).
По результатам исследования содержания гликогена в клетках немитотического пула нейтрофильных предшественников можно заметить, что в процессе дифференцировки костномозговых нейтрофилов обеих подопытных групп, начиная с ранних стадий, имеет место нарушение синтеза и накопления гранул гликогена. Наиболее выраженное снижение запасов гликогена выявлено на более поздних стадиях нейтрофилоцитопоэза.
Эти результаты находятся в полном соответствии с изменением среднего гистохимического показателя, отражающего содержание гликогена в расчёте на одну клетку (рисунок).
Как видно из рисунка, средний гистохимический показатель миелобластов, промиелоцитов и миелоцитов крысят с поражением печени незначительно снижен по сравнению с контролем. В процессе дифференцировки костномозговых нейтрофилов экспериментальных животных содержание гранулярного гликогена в них увеличивается. При этом у подопытных крысят содержание данного энергетического субстрата существенно снижено по сравнению соответствующим контролем. Вероятно, клетки контрольных животных по мере созревания приобретают способность накапливать гликоген в значительных количествах, что необходимо для выполнения основных функций нейтрофилов, в том числе фагоцитарной и киллинговой. Вместе с тем, снижение содержания гликогена в нейтрофилах потомства матерей с хроническим поражением печени может обусловить угнетение их фагоцитарных свойств и, как следствие, депрессию неспецифической резистентности [9].
Средний гистохимический показатель накопления гликогена нейтрофилами экспериментальных животных
Заключение
Полученные результаты позволяют говорить о том, что экспериментальное хроническое поражение гепатобилиарной системы матери по своим морфологическим, биохимическим и физиологическим характеристикам аналогичное гепатитам А и В, негативно влияет на способность костномозговых нейтрофилов потомства синтезировать и накапливать гликоген, являющийся основным энергетическим субстратом клетки. У подопытных животных происходит уменьшение числа гликогенпозитивных клеток и содержания гранулярного гликогена в каждой клетке. Полученные результаты позволяют предположить, что у самок крыс с хроническим поражением печени рождается потомство с нарушением нейтрофилоцитопоэза.
Рецензенты:
-
Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации», г. Челябинск;
-
Кривохижина Л.В., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой патологической физиологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации», г. Челябинск.
Работа поступила в редакцию 03.08.2012.