Создание и исследование ФФК является важным и актуальным направлением на пересечении ряда областей биохимии, физико-химической биологии и биотехнологии [1, 3, 4, 6, 8].
Для многих флуорофоров (молекулярных роторов) характерна сильная зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости. Для её описания обычно используют уравнение Фёрстера-Гофмана [4, 6]:
lgI = x×lg η + C, (1)
где I - интенсивность флуоресценции; х - константа, меньше либо равная единице; η - вязкость; С - постоянная. Из уравнения, зная интенсивность флуоресценции, находят вязкость после калибровки параметров флуорофора по разным вязкостям в системе, где его планируют использовать.
Спектральные свойства красителей родаминового ряда также зависят от вязкости (хотя молекулярными роторами они не являются) и рН [8]. Фотоактивируемые флуоресцентные красители родаминового ряда в этом плане интересны потому, что, облучая окрашенные клетки узким лазерным пучком длиной волны около 400 нм, можно активировать строго ограниченное число молекул ФФК, переведя их во флуоресцентную форму лишь в ограниченном объёме клетки [3]. Данные по влиянию вязкости и рН на флуоресценцию этих красителей можно будет использовать для исследования параметров внутриклеточной среды в различных клеточных структурах [1, 6], что имеет немалое значение для изучения биохимических процессов [2].
Для родаминовых красителей характерно явление концентрационного тушения [7]. Для практического применения красителей важно знать, при каких концентрациях оно начинает оказывать заметное влияние на спектральные свойства.
Целью данной работы являлось изучение влияние параметров микроокружения и концентрационного тушения на спектральные свойства ФФК-813 (его открытой формы, называемой Род-813).
Материалы и методы исследования
Исследуемый краситель (ФФК-813) синтезирован Беловым В.Н. в Макс-Планк Институте биофизической химии (ФРГ), как описано ранее [5].
Для исследования ФФК-813 был растворён в ДМФА до концентрации 10 мг/мл. Далее разбавляли водой до концентрации 200 мкг/мл и подвергали фотоактивации в стандартной кювете для снятия спектра из набора Spectra Suite действием ртутной лампы (100 Вт), помещаемой на расстоянии 3 см от кюветы на 5 минут. Данной операцией переводили краситель из нефлуоресцентной во флуоресцентную форму, как показано на рис. 1, а, и получали маточный раствор:
Рис. 1. а - структурные формулы ФФК-813 и флуоресцентного красителя Род-813, схема фотореакции;
б - протонирование и депротонирование Род-813; в ̶ структурные формулы родамина В и родамина 6Ж
Для получения спектров Род-813 при рН = 3, 7 и 11 использовали маточный раствор Род-813, дистиллированную воду и 0,01 Н растворы KOH и HCl.
Для исследования зависимости спектральных свойств от вязкости были приготовлены по 975 мкл растворов глицерина в воде в различных концентрациях, к которым добавляли 25 мкл маточного раствора.
Для исследования концентрационного тушения были измерены спектральные свойства Род-813 в растворах убывающих концентраций, приготовленных из маточного путём последовательно повторяемого разбавления его дистиллированной водой.
Для каждого случая были измерены как спектр поглощения, так и флуоресценции на спектрометре «Ocean Optics USB 4000-FL». Измерения проводились в стандартных пластиковых кюветах. Спектр поглощения измеряли с помощью источника света Ocean «Optics PX-2», излучающего в диапазоне 220-750 нм, свет от которого наводился на кювету при помощи оптоволоконного кабеля P400-1-SR; для возбуждения флуоресценции применяли светодиод с длиной волны света 514 нм, который устанавливали в кюветодержатель прибора в неподвижном положении.
Все спектры получены в сравнении с контролями, в качестве которых служили дистиллированная вода или растворы глицерина соответствующей концентрации. В экспериментах по концентрационному тушению для каждой концентрации снимали по 5 спектров поглощения и флуоресценции, в этом случае данные были обработаны путём подсчёта доверительных интервалов по методике Стьюдента.
Для окрашивания монослоя линии клеток А 431 (эпидермоидная карцинома человека) краситель сначала растворяли в ДМФА, а затем разводили в воде до концентрации 200 мкг/мл, также как для спектральных измерений. Раствор красителя добавляли в ячейку планшета с предварительно выращенным на покровном стекле монослоем клеток до конечной концентрации раствора 5 мкг/мл. Клетки инкубировали с красителем 30 мин в СО2-инкубаторе, затем дважды отмывали свежей средой культивирования. Покровное стекло вынули из ячейки, положили на предметное стекло клетками между стекол и немедленно микроскопировали. Данный препарат необходимо быстро исследовать, до того как испарится питательная среда между стекол. На лазерном конфокальном инвертированном микроскопе «Nikon Eclipse TE2000», используя лазеры 405 (для фотоактивации) и 543 нм, микроскопировали полученный клеточный препарат.
Результаты исследования и их обсуждение
Влияние рН. Спектры поглощения и флуоресценции растворов Род-813 концентрацией 5 мкг/мл при рН = 3, 7 и 11 изображены на рис. 2. При рН = 3 интенсивность поглощения и флуоресценции была больше, чем при рН = 7 и 11, причём прирост интенсивности флуоресценции при рН = 3 по сравнению с нейтральной и щелочной средой был больше, чем прирост поглощения, что указывает на больший квантовый выход Род-813 при кислом рН. При рН = 3 длина волны максимума поглощения была явно меньше (549 нм), чем при рН = 7 и 11 (554 и 553 нм). Разница между значениями длин волн максимума абсорбции при рН = 7 и 11 и между значениями длин волн максимумов флуоресценции для всех рН (значения максимумов находились в интервале 575-576 нм) сопоставима с приборной погрешностью (около 1 нм) и не является достоверной. Согласно структурной формуле Род-813, это соединение должно находиться при рН = 3 в катионной форме, а при рН = 11 - в цвиттерионной (рис. 1, б). Исходя из полученных данных, спектр цвиттериона смещён батохромно, что противоречит данным работы [8] для родамина В (формула на рис. 1, в). Но родамин В, в отличие от Род-813, имеет карбоксильную группу при сопряжённой системе (а у Род-813 она отделена от сопряжённой системы метиленовой группой), и, значит, протонирование-депротонирование данной группы Род-813 не окажет такое же влияние на спектральные свойства, какое оказывала в родамине В. В случае точечного детектирования флуоресценции в живых клетках этот эффект необходимо учитывать. Уменьшение внутриклеточного рН увеличивает интенсивность флуоресценции в клеточных препаратах.
Рис. 2. Спектр поглощения (1а) и флуоресценции (1б) при рН = 3; поглощения (2а) и флуоресценции (2б) при рН = 7; поглощения (3а) и флуоресценции (3б) при рН = 11
Концентрационное тушение. График на рис. 3 и данные, представленные в таблице, свидетельствуют в пользу того, что, как и родамину 6Ж (формула на рис. 1, в) [7], исследованному нами красителю присуще явление концентрационного тушения.
Рис. 3. Зависимость интенсивности флуоресценции ФФК-813 от его концентрации в дистиллированной воде
Линейная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации для Род-813 наблюдается вплоть до значений около (3 - 5)·10-5 М (14-25 мкг/мл), далее рост замедляется; наибольшая интенсивность флуоресценции наблюдается при концентрациях около 6,3·10-5 М (30 мкг/мл). Далее она резко падает (рис. 3). Примерно до этих же концентраций наблюдается прямая пропорциональность между концентрацией и оптической плотностью, а далее наблюдается отклонение от закона Бугера-Ламберта-Бэра, что свидетельствует об образовании ассоциатов, ответственных за эффект концентрационного тушения [7]. Начиная с концентрации 10-4 М (47 мкг/мл) максимум спектра флуоресценции сдвигается батохромно и в исследованном диапазоне концентраций доходит далее до 625 нм, что объясняется перекрыванием π-электронных облаков молекул, сопровождающемся увеличением степени делокализации электронов, а в сопряжённых системах это всегда приводит к батохромному сдвигу максимума флуоресценции. Труднее объяснить гипсохромный сдвиг спектра поглощения. Возможно, он вызван тем, что в ассоциатах может быть затруднён перенос зарядов от элетронодонорной к электроноакцепторной группе, часто сопровождающий процесс возбуждения [4, 6], что может приводить к затруднённости самого процесса возбуждения, необходимости большей энергии поглощаемого кванта для него. Ясно, что при окрашивании красителем ФФК-813 живых клеток нецелесообразно использовать количества красителя, создающие его конечную концентрацию в окрашиваемом материале более чем 6,3·10-5 М (25-30 мкг/мл).
Спектральные свойства Род-813 при разных концентрациях красителя
|
Концентрация ФФК, моль/л (мкг/мл) |
Измеренная оптическая плотность |
Длина волны максимума поглощения, нм |
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.×10-3 |
Длина волны максимума флуоресценции, нм |
|
3,985×10-6 (1,9) |
0,127 ± 0,004 |
551,6 ± 0,5 |
24,3 ± 1,1 |
574,7 ± 0,0 |
|
6,315×10-6 (3,0) |
0,154 ± 0,008 |
552,1 ± 0,3 |
28,8 ± 1,5 |
574,7 ± 0,0 |
|
1×10-5 (4,7) |
0,199 ± 0,006 |
551,83 ± 0,18 |
36,1 ± 0,9 |
574,7 ± 0,0 |
|
1,586×10-5 (7,5) |
0,274 ± 0,003 |
551,71 ± 0,14 |
46,0 ± 1,0 |
575,5 ± 0,0 |
|
2,514×10-5 (12) |
0,398 ± 0,002 |
551,8 ± 0,5 |
58,7 ± 1,2 |
575,8 ± 0,0 |
|
3,983×10-5 (19) |
0,606 ± 0,003 |
551,8 ± 0,2 |
72 ± 2 |
577,1 ± 0,0 |
|
6,313×10-5 (30) |
0,921 ± 0,006 |
552,07 ± 0,12 |
79 ± 2 |
578,5 ± 0,0 |
|
1×10-4 (47) |
1,46 ± 0,10 |
552,4 ± 1,0 |
76 ± 2 |
580,5 ± 0,0 |
|
1,586×10-4 (75) |
1,622 ± 0,005 |
544,0 ± 0,8 |
53,1 ± 1,9 |
584,1 ± 0,0 |
|
2,514×10-4 (118) |
1,78 ± 0,08 |
530,5 ± 1,1 |
30 ± 3 |
602 ± 4 |
|
3,983×10-4 (187) |
1,83 ± 0,22 |
530,5 ± 1,2 |
19 ± 4 |
622 ± 3 |
|
4,474×10-4 (200) |
Нет данных |
Нет данных |
13 ± 1,9 |
624,8 ± 0,3 |
Влияние вязкости. Влияние вязкости на интенсивность флуоресценции определяли в растворах глицерина разной концентрации. Поскольку коэффициент экстинкции красителя от вязкости не зависит, но фактически оптическая плотность в этих растворах менялась из-за разной растворимости соединения, то учитывалась эффективная интенсивность, рассчитанная как
где Ifl - приборная интенсивность флуоресценции; D - измеренное поглощение; Dnom - номинальное поглощение, наблюдавшееся в воде.
Рис. 4. Зависимость логарифма интенсивности флуоресценции ФФК-813 от вязкости водных растворов с разной концентрацией
Согласно уравнению (1) зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости должна иметь вид прямой в логарифмических координатах, что и видно из рис. 4. При этом тангенс наклона полученной прямой, то есть постоянная «х», равная 0,141. Константа С = 4,179. Не очень большая величина х говорит об умеренной зависимости интенсивности флуоресценции от вязкости. При увеличении вязкости в 1000 раз интенсивность флуоресценции возрастает в 2,5 раза. Окрашенные клетки линии А 431 представлены на микрофотографии с горизонтальной линией, по которой построен профиль интенсивности флуоресценции (рис. 5). Взяв из полученного спектра значения максимумов интенсивности флуоресценции и разделив на минимум, получаем в среднем от 5 до 10, т.е. во столько раз интенсивность флуоресценции ярких частей клеток отличаются от темных. Из вышеописанных экспериментов следует, что такая разница связана не только с селективностью окрашивания красителя определённых структур, но и с различными свойствами микроокружения (вязкости, рН).
Рис. 5. Микрофотография монослоя живых клеток A 431 окрашенных ФФК-813 концентрацией 5 мкг/мл (1,06×10-5М), после фотоактивации (размер кадра 36 на 36 мкм, сверху) и соответственно спектр интенсивности флуоресценции по горизонтальной линии (внизу)
Выводы
рН среды влияет на интенсивность флуоресценции Род-813, которая в 1,5-2 раза больше у катионной формы по сравнению с цвиттерионной. Зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости подчиняется уравнению Фёрстера-Гофмана, при увеличении вязкости в 1000 раз интенсивность флуоресценции возрастает в 2,5 раза.
Для красителя характерно концентрационное тушение с образованием малофлуоресцирующих ассоциатов, начиная с концентраций от 6,3×10-5 М (30 мкг/мл), что необходимо учитывать при его практическом использовании для окрашивания клеток.
В разных участках живых клеток, окрашенных с помощью ФФК-813, интенсивность флуоресценции отличается между визуально яркими и темными внутриклеточными структурами в среднем от 5 до 10 раз, что обусловлено не только различной селективностью связывания красителя, но и неоднородностью параметров внутриклеточной среды.
Рецензенты:
-
Белопухов С.Л., д.с.-х.н., к.х.н., профессор, заведующий кафедрой физической и коллоидной химии, Министерство сельского хозяйства Российской Федерации, ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева», г. Москва;
-
Клопов М.И., д.б.н., профессор кафедры химии, Министерство сельского хозяйства Российской Федерации, ГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный заочный университет», г. Балашиха.
Работа поступила в редакцию 23.07.2012.