Ионизирующее излучение оказывает многостороннее повреждающее воздействие на живые организмы. По мнению многих исследователей в основе повреждающего воздействия на клеточном уровне лежит образованием активных форм кислорода (АФК) [15]. АФК возникают в результате радиолиза воды и являются продуктом непосредственного взаимодействия фотонов высокой энергии с водой. К АФК относят короткоживущие радикалы - гидроксильный радикал и супероксид анион радикал, а также перекись водорода. Из трех представителей АФК, только гидроксильный радикал является непосредственным продуктом радиолиза воды [8]. Супероксид анион радикал и перекись водорода называют вторичными АФК. Они генерируются в результате протекания цепных радикальных реакций инициируемых гидроксильным радикалом. Теоретические расчёты продемонстрировали, что количество вторичных радикалов возникающих после радиационного воздействия соответствует количеству АФК генерируемых в процессе нормального метаболизма клетки. Вторичные АФК могут генерироваться в результате ряда внутриклеточных процессов, среди которых процессы дыхания, NADPH оксидаза, ксантиноксидаза и ряд других процессов [4]. Основным поставщиком супероксид анион радикала и перекиси водорода являются митохондрии. При нормальных условиях от 1 до 4 процентов кислорода, поглощаемых клеткой превращается при участии дыхательной цепи в АФК [5]. Активные формы кислорода, генерируемые в процессе патологического клеточного метаболизма, могут выступать в качестве повреждающих агентов и инициировать клеточное повреждение и смерть [9]. Ионизирующее излучение может также вызывать повреждения биологических молекул путем разрыва химических связей. ДНК наиболее чувствительная к воздействию ионизирующего излучения, что проявляется через образование разрывов цепей ДНК, которые происходят в результате гидролитического разрыва фосфодиэфирной связи после переноса свободного радикала с основания на рибозный остаток [12]. Процессы свободно-радикального повреждения ДНК служат причиной мутаций и возникновения генетической нестабильности приводящим к формированию радиорезистентных клеточных клонов. [1]. Митохондриальная ДНК является менее защищённой от стрессовых воздействий, по сравнению с ядерной ДНК [2]. Радиация может оказывать существенное влияние на митохондрии, что проявляется через нарушение проницаемости митохондриальных мембран, нарушение синтеза АТФ, проникновением Ca2+ в митохондриальный матрикс и снижением митохондриального потенциала [7]. Таким образом, повреждённые митохондрии могут стать причиной увеличения внутриклеточной концентрации АФК и вызвать отсроченное во времени повреждение ДНК и возникновение генетической нестабильности и радиационно устойчивых клонов раковых клеток.
В настоящей работе нами предпринята попытка изучить динамику и причины возникновения и развития радиационно-индуцированного оксидативного стресса в раковых клетках и оценить роль митохондрий в этом процессе.
Материал и методы исследования
В экспериментах использовали клеточную линию миелогенной лейкемии человека К562. Клетки культивировали при 37 С, во влажной атмосфере содержащей 5% СО2. Для культивирования использовали среду RPMI-1649 содержащей L-глутамин, 15% фетальной коровьей сыворотки и 0,04% гентамицина. Клетки облучали рентгеновским излучением генерируемым терапевтическим акселератором Clinac 600 при комнатной температуре в дозах 4 и 12 Грэй одноразово. Мощность дозы составляла 0,03 Гр/с, при фокусном расстоянии 104 см, поле облучения 30 см. Высота водяного столба над клетками составляла 1 см. Клетки облучались в 24 луночных планшетах (объём лунки 2,5 мл.). Параметры оксидативного стресса и повреждения ДНК анализировались через 15, 30 минут, 1, 4, 8, 12, 24, 48 часов.
Внутриклеточную концентрацию активных форм кислорода определяли с использованием 2′,7′--дихлородигидрофлуоресцеин диацетата (DCFH-DA) [11]. DCFH-DA добавляли в среду с клетками в конечной концентрации 30 мкМ за 30 мин до анализа и держали в СО2-инкубаторе при 37°С в темноте. Интенсивность флуоресценции дихлорофлуоресцеина измеряли с использованием проточного цитометра Becton Dickinson FACS Canto (лазер 488 нм, LP зеркало - 503, BP фильтр - 530/30). Для исследования роли митохондрий в процессах генерации АФК мы использовали ротенон, который является ингибитором комплекса I дыхательной цепи [10]. Ротенон добавляли в среду за 20 минут до начала определения АФК в конечной концентрации 1мкМ.
Митохондриальный потенциал определяли с использованием флуоресцентного красителя этилового эфира тетрародоминперхлората (TMRE) [3]. TMRE добавляли в среду с клетками в конечной концентрации 200 мкМ за 20 мин до анализа и держали в СО2-инкубаторе при 37°С. После инкубации среду удаляли, добавляли равный объём фосфатного буферного раствора рН 7,4 и определяли интенсивность красной флуоресценции с использованием проточного цитометра Becton Dickinson FACS Canto (лазер 488 нм, LP зеркало - 556, BP фильтр - 585/42).
Все эксперименты и определения параметров были выполнены как минимум с трёхкратных повторением. Результаты выражались как средние значение ± стандартное отклонение (М ± SD). Результаты обработаны статистически с использованием критерия t-Стьюдента для парных переменных. Различия между группами считали достоверными при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Динамика изменения внутриклеточной концентрации АФК в клетках К562 после облучения в дозах 4 и 12 Грэй представлена на рис. 1. Как видно, концентрация АФК и имеет два максимума. Первый максимум наблюдается через 30 минут после облучения и превосходит концентрацию АФК контрольных клеток в 1,35 и 1,67 раза при облучении клеток дозами 4 и 12 Грей соответственно. При определении концентрации АФК через 4 после облучения, оказалось, что она практически не отличается от таковой в контрольных клетках. Через 24 часа после облучения мы наблюдали второй максимум внутриклеточной концентрации АФК. При облучении клеток дозой в 4 Грея концентрация АФК в 1,83 раза превосходила аналогичный параметр в культуре клеток не подвергавшихся облучению, и в 2,16 раза если клетки подвергались облучению в дозе 12 Гр. Далее, через 48 часов после облучения, происходило некоторое снижение внутриклеточной концентрации АФК.
Для оценки вклада митохондрий в генерацию АФК после облучения мы использовали ротенон, который является ингибитором комплекса I дыхательной цепи [10]. На рис. 2 представлены данные отражающие влияние ротенона на концентрацию АФК. Как видно из графика ротенон не влиял на концентрацию АФК если он добавлялся через 30 минут после облучения. Ротенон снижал концентрацию АФК если его добавляли к клеточной культуре через 24 и 48 часов после облучения (рис. 1). В точке 24 часа после добавления ротенона концентрация АФК в клетках облучавшихся дозами 4 и 12 Гр была всего лишь в 1,14 и 1,18 раз выше чем в контрольной группе, тогда как без добавления ротенона она была соответственно в 1,52 и 1,61 раз выше чем в контроле. В группе 4 Гр при добавлении ротенона она статистически достоверно не отличалась от таковой в контрольной группе (см. рис. 1). При проведении аналогичного эксперимента по прошествии 48 часов после облучения нами наблюдалась схожая картина.
Рис. 1. Влияние ротенона на концентрацию АФК в клетках К562. Данные представлены как отношение величины флуоресценции DCFH-DA в клетках подвергшихся рентгеновскому облучению с к контрольной группе в присутствии ротенона и без него. (* - p < 0,05 в сравнении с контрольной группой, # - р < 0,05 в сравнении с аналогичной группой без добавления ротенона)
Радиационно-стимулированная генерация активных форм кислорода является давно известным фактом. Считается, что АФК служат основной причиной повреждающего действия радиации [15]. Также, хорошо известно, что радиоактивное облучения может вызывать отдалённые последствия, связанные с возникновением нестабильности генома [1]. Генетически нестабильные линии клеток служить причиной злокачественной трансформации нормальных клеток и возникновения радиационно-устойчивых клонов раковых клеток [1]. В ряде работ продемонстрировано, что генетически нестабильные клетки характеризуются повышенной продукцией АФК, источниками которых, могут являться митохондрии [2]. Однако, до сих пор неизвестно, что является первоначальным событием возникновение генетической нестабильности, а затем увеличение генерации митохондриями АФК или митохондриально генерируемые АФК служат причиной генетической нестабильности [6]. В этой связи необходимо выяснить кинетику и источники радиационно-индуцируемых АФК на протяжении достаточного промежутка времени для возникновения признаков генетической нестабильности. Из результатов экспериментов видно, что внутриклеточная концентрация АФК после однократного облучения дозами 4 и 12 Гр имеет в обоих случаях два максимума через 30 минут и 24 часа после облучения (рис. 2).
Источником АФК при нормальных условиях, могут быть различные клеточные процессы, к которым можно отнести побочные продукты деятельности дыхательной цепи, НАДФН оксидазы, ксантин оксидазы и оксигеназы арахидоновой кислоты [4]. При облучении клеток добавляется ещё один источник свободных радикалов - это радиолиз воды [15]. Однако, по мнению многих исследователей самым значительным из них является митохондриальная дыхательная цепь [5]. Добавление ротенона вызывало снижение внутриклеточной концентрации АФК только во время второго максимума, т.е. 24-48 часов, тогда как добавление ротенона сразу после облучения не влияло на концентрацию АФК (рис. 2). На основании этого эксперимента мы сделали заключение, что сразу после облучения ведущая роль в генерации АФК не связана с митохондриями, тогда как, позднее, начиная с 12 часа после облучения, главный вклад в развитие оксидативного стресса начинают вносить митохондрии.
Митохондриальный мембранный потенциал является важным показателем метаболической активности клеток, кроме этого он отражает способность митохондрий генерировать АФК. Из ранее проведённых исследований известно, что генерация АФК зависит от митохондриального мембранного потенциала и с его увеличением количество АФК генерируемых митохондрией также увеличивается [13]. На графике 3 представлены данные отражающие изменение митохондриального мембранного потенциала после облучения клеток в дозах 4 и 12 Грэй. Если клетки облучались разовой дозой в 4 Гр, то статистически достоверное повышение мембранного потенциала митохондрий мы могли наблюдать только через 12 часов после облучения. В этот момент времени мембранный митохондриальный потенциал был в 1,12 раз больше чем в контроле. Через 24 и 48 часов этот показатель составлял 1,22 и 1,14 от аналогичного показателя контрольной группы. В группе клеток подвергшихся облучению мощностью 12 Гр рост митохондриального мембранного потенциала был более существенным и наблюдался в более ранние сроки. Так уже через 4 часа нами было зафиксировано статистически достоверное различие в сравнении с контрольной группой (рис. 3).
Рис. 2. Динамика изменения активных форм кислорода после облучения клеток линии К562 рентгеновским излучением в дозах 4 и 12 Грэй
Рис. 3. Динамика изменения митохондриального потенциала после облучения клеток линии К562 рентгеновским излучением в дозе 4 и 12 Грэй. Данные представлены как отношение величины флуоресценции TMRE в клетках подвергшихся рентгеновскому облучению к аналогичному показателю клеток контрольной группы. (* - p < 0,05 в сравнении с контрольной группой)
В дальнейшем увеличении мембранного потенциала митохондрий в группе клеток подвергшихся облучению в дозе 12 Гр был ещё более существенным с максимальным значением в точке 48 часов, в которой он был в 2,03 раза выше, чем в клетках контрольной группы. Увеличение продукции митохондриально-зависимой АФК, по нашему мнению связано с повреждением митохондрий рентгеновским излучением из-за более высокой чувствительности митохондриальной ДНК к радиационному воздействию [14].
Заключение
Таким образом, можно сделать заключение, что радиационно-индуцированная генерация АФК в клетках К562 имеет два временных максимума и различные источники. Причиной увеличения радиационно-индуцированной концентрации АФК через 24-48 часов можно назвать рост митохондриального потенциала.
Работа выполнена при поддержке гос. задания МИНОБРНАУКИ России.
Рецензенты:
-
Генинг Т.П., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой физиологии и патофизиологии Ульяновского государственного университета, г.Ульяновск;
-
Светухин В.В., д.ф.-м.н., профессор, директор Научно-исследовательского технологического института Ульяновского государственного университета, г. Ульяновск.
Работа поступила в редакцию 03.07.2012.