Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Биоиндикационные методы оценки состояния природной среды используются в современных экологических исследованиях [1]. Одной из многочисленных и представленных во всех биогеоценозах групп почвообитающих животных - биоиндикаторов являются дождевые черви. По их количеству и состоянию можно судить о степени загрязнения почв [2, 5]. Актуальность изучения роли дождевых червей как биоиндикаторов территорий, загрязненных пестицидами, определяется в первую очередь тем, что эти вещества вызывают ответную реакцию животных [3, 4]. Данные реакции зависят не только от длительности загрязнения, но и от дозы загрязнителя. В научных публикациях практически отсутствуют данные о влиянии пестицидов на дождевых червей. Актуальность и недостаточная изученность данной проблемы послужила предпосылкой для настоящего исследования.

Для оценки влияния пестицидов на поведенческие реакции и выживаемость дождевых червей использовали специальные лабораторные кюветы из органического стекла (0,4×0,15×0,02 м). Размеры посуды подбирались исходя из рекомендаций по характеру распределения дождевых червей по профилю почвы. По данным Д.А. Криволуцкого [3], основное количество особей располагается в поверхностном слое почвы на глубине 10-20 см. В кюветы помещалась усредненная проба гумусового слоя чернозема выщелоченного, влажностью 30 ± 10%, по одному килограмму загрязненной почвы в каждой кювете. Затем в них помещали 10 дождевых червей Lumbricus terrestris L.

Почва для модельных лабораторных исследований была отобрана с территории станции «Опытная» (верхний 10-20 см слой), затем просушена и просеяна через сито с ячейкой 5 мм. Влажность доводили дистиллятом до 70%. К почве (pH = 6,85) для питания червей добавляли ферментированный навоз из расчета 20% от общей массы (pH = 8,3). Полученный субстрат перемешивали.

В экспериментах использовались половозрелые особи дождевого червя Lumbricus terrestris из маточной популяции. В первом опыте червей вносили через сутки после подготовки субстрата по 10 особей в контейнер, содержали 7 дней при T_{воздуха} = 20 ± 2°С. Во втором - по 10 особей на контейнер, содержали 28 дней при T_{воздуха} = 20 ± 2°С.

Для создания модельного загрязнения в лабораторных условиях была использована дерново-подзолистая почва с территории станции «Опытная» (верхний 10 см слой), затем просушена и просеяна через сито с ячейкой 3 мм. Влажность доводили дистиллятом до 70%. К почве (pH = 6,85) для питания червей добавляли ферментированный навоз из расчета 20% от общей массы (pH = 8,3). Полученный субстрат перемешивали, в смесь вносили растворы исследуемых пестицидов различных концентраций, выбор которых основывался на рабочих инструкциях к препаратам. Загрязненную почву распределяли по кюветам (V = 3,3 дм³) навесками по 0,5 кг. Каждую концентрацию загрязнителя брали в трехкратной повторности. Было использовано 75 кювет.

В экспериментах использовались половозрелые особи дождевого червя Lumbricus terrestris из маточной популяции. В опытах червей вносили через сутки после подготовки субстрата по 10 особей в кювету. Данный промежуток времени был выбран как наиболее оптимальный для достижения стабилизации почвы и адаптации червей к новым условиям обитания. Эксперимент длился 7 дней для исследования острой токсичности препаратов и 28 дней - для исследования хронической токсичности препаратов и влияния на репродуктивную способность особей.

В качестве контроля использовали почву с территории полевых исследований с навозом, но без загрязнителей. Была зафиксирована 93% выживаемость червей в течение 28 дней. Таким образом, исходный субстрат соответствовал требованиям методики [3] и был пригоден для использования в экспериментах. Анализ почвы представлен в табл. 1.

Физико-химические показатели модельного субстрата - чернозема выщелоченного, (2008)

Степень токсичности исследуемых пестицидов устанавливалась с помощью верхней и нижней границ диапазона их токсического действия, т.е. испытывались концентрации, приводящие к гибели 100% дождевых червей (LD₁₀₀), а также дозы, не вызывающие иммобилизацию ни одного тест-организма в опытной группе (LD₀).

Анализ зависимости смертности дождевых червей от дозы внесения пестицида «Актара» в почву представлен в табл. 2.

Влияние инсектицида «Актара» на смертность червей в лабораторных условиях

Примечание: * - различия по сравнению с контролем существенны при р < 0,05.

Препарат «Актара» в малой концентрации 0,01 г/кг почвы не вызвал иммобилизацию дождевых червей. Наблюдения показали, что количество особей оказалось постоянным на протяжении всех 7 дней исследования и составило по 10 экз. на каждую лабораторную кювету (см. табл. 2).

Концентрация препарата 0,1 г/кг почвы оказалась более токсичной, и, начиная с 5 суток эксперимента, смертность дождевых червей составила 0,6 ± 0,1 особей. На 6 сутки исследования смертность оставалась на прежнем уровне, лишь на 7 день возросла до 1,2 ± 0,1 экз. на лабораторную кювету. При увеличении концентрации препарата до 1 г/кг почвы наблюдения показали стабильную динамику смертности практически всех особей еще в 1 сутки эксперимента, что составило 9,8 ± 0,4 экз. на лабораторную кювету, а затем осталась неизменной до последнего дня эксперимента.

Максимальная доза препарата 10 г/кг почвы вызвала 100% гибель всех дождевых червей на вторые сутки исследования в течение первых 5 часов.

Реакции червей в течение первых 10-30 минут после внесения препарата «Актара» можно классифицировать по поведению на три группы, основываясь на исследовании Козлова К.С. (2003).

1. Отсутствие изменений в поведении. Поведенческие реакции оказались без изменений по отношению к таковым наблюдаемым до внесения препарата. Количество червей, отнесенных к данной реакции, составило в среднем 45%. В основном это особи, которые находились на дне экспериментальных осадков или в придонной части. Такая же реакция была характерна практически для всех дождевых червей, обработанных дозами препарата 0,01 и 0,1 г/кг почвы.
2. «Пограничный таксис». Дождевые черви поднимаются до границы просачивания препарата, начинают двигаться вдоль нее, проявляя ответную реакцию на загрязнение, в поисках незагрязненной почвы. Количество червей, отнесенных к данной реакции, составило в среднем 30%.
3. «Вертикальный таксис». Дождевые черви проходят загрязненный пестицидами слой почвы перпендикулярно границе просачивания и выходят на поверхность. Количество червей отнесенных к данной реакции составило около 25%.

Анализируя поведенческие реакции дождевых червей на загрязнение, можно сказать, что наиболее лучшей формой двигательной активности для выживаемости червей является реакция горизонтальной миграции из зоны загрязнения в чистую почву - реакция «пограничного таксиса». Гибель червей, проходящих слой почвы, загрязненной пестицидами, перпендикулярно границе просачивания и выходящих на поверхность, составляет 100%.

К реакции «вертикального таксиса» можно отнести следующие стадии:

• сокращение кожно-мускульного мешка;
• снижение двигательной активности;
• захватывающие движения ротовым отверстием;
• иммобилизация.

Таким образом, Lumbricus terrestris оказались чувствительными к воздействию малых концентраций хлорорганического пестицида «Актара».

Препарат «Гезагард» в концентрациях от 0,01 до 0,1 г/кг почвы не оказал влияния на смертность дождевых червей. Наблюдения показали, что количество особей оказалось неизменным на протяжении всех 7 дней исследования и составило по 10 экз. на каждую лабораторную кювету (табл. 3).

Влияние гербицида «Гезагард» на смертность червей в лабораторных условиях

Примечание: * - различия по сравнению с контролем существенны при р < 0,05.

Концентрация препарата 1 г/кг почвы оказалась более эффективной, и, начиная с 6 суток эксперимента, смертность дождевых червей составила в среднем 1,4 ± 0,4 особей. На 7 день смертность особей возросла до 1,6 ± 0,3 экз. на лабораторную кювету. При увеличении концентрации препарата до 10 г/кг почвы отмечена стабильная возрастающая динамика смертности особей, начиная со 2 суток экспериментов, что составило 0,8 ± 0,4 экз. на лабораторную кювету. В каждый из последующих дней происходило незначительное увеличение данного показателя с 1,2 ± 0,2 экз. на третий день исследования до 6,2 ± 0,4 экз. на 6 сутки. К концу эксперимента смертность составила 7,2 ± 0,62 особей на кювету. Анализируя полученные экспериментальные данные, можно утверждать, что токсичность препарата зависит не только от дозы внесения, но и от времени экспозиции.

Так как доза в 10 г/кг почвы оказалась сублетальной, тестировалась концентрация «Гезагарда» 50 г/кг.

Максимальная доза препарата в 50 г/кг почвы вызвала почти 95%-ю гибель всех дождевых червей к концу эксперимента. В 1 сутки исследования смертность составила 4,8 ± 0,9 экз. на лабораторную кювету. На второй день показатель вырос до 5,8 ± 0,8, на третий до 7,4 ± 0,5, на 8,2 ± 0,6 на четвертый, на 9,0 ± 0,3 на пятый, до 9,4 ± 0,2 на шестой и до 9,6 ± 0,2 на седьмой день исследования. Увеличение тенденции гибели особей предположительно связано с накоплением метаболитов препарата в тканях червей, попадающих в особей с пищей или благодаря абсорбции внешних краней.

Менее выраженная токсичность «Гезагарда» по сравнению с «Актарой» обусловлена тем, что данный пестицид является неспецифическим для данной группы организмов.

Поведенческие реакции дождевых червей в течение первых 10-30 минут в условиях загрязнения почвы препаратом «Гезагард» также можно классифицировать вышеуказанными характеристиками. К первой группе относятся в среднем 65% особей, находившихся на дне экспериментальных осадков или в придонной части. Также эта реакция была характерна практически для всех дождевых червей с дозами препарата 0,01, 0,1 и 1 г/кг почвы. Ко второй группе относятся в среднем 15%, к третьей - около 20%.

Анализ действия биологического препарата на основе белкового дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis показал, что смертность червей наступает лишь при концентрации препарата 10 г/кг почвы на шестые сутки исследования. Она составила 0,4 ± 0,1 экз. на лабораторную кювету и являлась статистически не достоверной. В концентрациях от 0,01 и до 1 г/кг почвы поведение червей оставалось неизменным как до внесения пестицида в почву (табл. 4).

Влияние инсектицида «Дельта-2» (на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis)
на смертность червей в лабораторных условиях

Примечание: * - различия по сравнению с контролем существенны при р < 0,05.

При внесении в почву препарата максимальной концентрации смертность червей наступила на четвертые сутки и составила 0,8 ± 0,2 особи на лабораторную кювету. К седьмому дню эксперимента смертность дождевых червей возросла до 1,4 ± 0,2 экз. на кювету, но оказалась статистически незначимой.

Реакция червей в течение первых 10-30 минут после внесения препарата «Дельта-2» на основе дельта-эндотоксина была практически одинаковой у всех особей во всех анализируемых концентрациях. Поведенческие реакции оказались без изменений (как до внесения препарата). Количество червей, отнесенных к данной реакции, составило в среднем 95%.

Таким образом, можно сделать вывод о безопасности применения инсектицидного препарата на основе белкового дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на представителей мезофауны на примере дождевых червей.

Тест на репродуктивную способность проводили по методике регистрации репродуктивных показателей дождевых червей (EPS 1/RM/43, 2007). Для этого их помещали в кюветы с загрязненной почвой при параллельном контроле на протяжении 28 дней (EPS 1/RM/43, 2007). Еженедельно подсчитывали процент выживших особей, коконы изымались, помещались для инкубации в чашки Петри с аналогичным субстратом (навески по 10 грамм на чашку) на 21 день при T_{воздуха} = 23 ± 2°С, влажности 80%. Через 3 недели содержимое чашек проверяли, ювенильных особей дождевых червей отсаживали, их количество регистрировали. Целые коконы оставляли в чашках еще на 7 дней, после чего процедуру повторяли. В таблице 6 представлены результаты восьминедельных исследований репродуктивной способности червей в загрязненном субстрате, а также результаты изучения токсического действия загрязненного субстрата на коконы (табл. 5).

Влияние загрязненного субстрата на репродуктивные показатели дождевых червей

Примечание. * при данных концентрациях загрязнителя черви переставали откладывать коконы. В загрязненный субстрат вносили коконы червей маточной популяции.

С помощью пробит-анализа кривых летальности и методу Прозоровского установлены медианные дозы препаратов LD₅₀ по результатам 7 дневных опытов для популяции дождевых червей (табл. 6).

Пробит-анализ позволяет расчетным методом определить токсикологические характеристики пестицидов для дождевых червей, отражающие колебания индивидуальной чувствительности организмов (рисунок).

Токсикологические характеристики исследуемых препаратов для дождевых червей (7-дневный эксперимент), г/кг

Примечание. Использовалось программное обеспечение StatPlus 2009 Professional 5.8.4 AnalystSoft.

Проведенные исследования позволяют сделать вывод, что при загрязнении почвы метаболитами «Актары» (в пределах 0,01-0,1 г/кг), «Гезагарда» (до 1 г/кг) и «Дельты-2» (в диапазоне 0,01-1 г/кг) коконы дождевых червей можно использовать для заселения загрязненных пестицидами территорий.

a

б

• Благовещенская Н.В., д.б.н., доцент, директор Ульяновского областного детского экологического центра, г. Ульяновск;
• Шустов М.В., д.б.н., профессор кафедры природопользования ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», г. Ульяновск.

Работа поступила в редакцию 03.07.2012