Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В последние годы в России официально регистрируется более 1,2 миллионов больных различными паразитоценозами, среди которых отмечается рост заболеваемости кишечными протозоозами [1].

Известно, что у лиц, страдающих заболеваниями пищеварительного тракта, очень высок показатель паразитарных инвазий, в частности бластоцистоза [2]. Данная протозойная инфекция этиологически ассоциирована с простейшими Blastocystis hominis, паразитирующими преимущественно в толстом отделе кишечника человека [8, 9].

Возбудитель бластоцистной инвазии является микроорганизмом, к усилению агрессии которого, с одной стороны, могут приводить факторы, снижающие защитные силы макроорганизма, а с другой стороны - микроорганизмы, входящие в состав биоценоза. Естественно, что при освоении биотопов тела человека между микробами складываются определенные взаимоотношения, которые отражаются на качественной и количественной характеристике того или иного микробного пейзажа [4].

Анализ направленности межмикробных взаимоотношений ассоциативных микросимбионтов позволяет прояснить патогенез широкого спектра заболеваний, правильно оценить происхождение тех или иных аномалий в структуре микросимбионтов, приводящих к изменению их типичных или проявлению новых биологических свойств [9].

Нарушая баланс микроорганизмов, данные возбудители способствуют созданию благоприятных условий для развития патологических процессов [8]. Результаты собственных исследований показали, что бластоцистная инвазия сопровождается качественными и количественными изменениями микрофлоры кишечника человека. Выявлено, что на фоне бластоцистоза увеличивается обсемененность толстой кишки условно-патогенными бактериями рода Enterococcus - Е.faecflis, которые относят к нормальным симбионтам. Интенсивные исследования последних лет позволили установить, что данные бактерии синтезируют существенное количество веществ, так называемых факторов вирулентности, способствующие развитию инфекционного процесса. К таким факторам можно отнести поверхностные белки, участвующие в процессе адгезии и инвазии, экскретируемые белки и токсины, обеспечивающие повреждение тканей хозяина, а также факторы, индуцирующие воспаление [7].

Ранее нами были изучены персистентные свойства энтерококков в монокультуре и при сокультивировании с Blastocystis hominis. Выявлено нарастание экспрессии персистентных характеристик у бактерий энтерококков при бластоцистозе, которое ограничивает размножение паразитов в кишечнике больных, что представляет собой процесс взаимной адаптации, направленный на обеспечении совместного длительного паразитирования в макроорганизме.

Тем не менее, не изученными остаются другие не мало важные биологические свойства бактерий рода Enterococcus и простейших Blastocystis hominis в ходе межмикробных взаимодействий, в частности в протозойно-бактериальных ассоциациях.

В связи с этим целью нашего исследования явилось изучение биологических свойств, таких как: сахаролитическая, протеолитическая, гемолитическая, колициногенная активности и антибиотикорезистентность бактерий Enterococcus и гемолитическая, ДНК-азная, протеолитическая, лецитоветилазная и липолитическая простейших Blastocystis hominis до и после совместного культивирования.

Исследования микробного пейзажа кишечника проводили в период с 2006 по 2010 года на базе бактериологических лабораторий ГУЗ «Покровская больница», городской клинической больницы №40 г. Санкт-Петербурга. Определение гемолитической, протеолитической, ДНК-азной и колициногенной активностей определяли по методике Биргера [5], липолитическую активность с использованием метода Slifkin [9], лецитоветилазную по методике Теца [6], антибиотикочувствительность исследуемых культур определяли с использованием методике Навашина, Чучалина, Белоусова [3]. Микробный пейзаж кишечника изучали согласно Приказу № 535 от 22.04.85 МЗ РСФСР «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях и лечебно-профилактических учреждениях». Выявление бластоцист в препаратах проводили путем микроскопии нативных или окрашенных мазков. Для получения культур простейших B.hominis использовали среду Suresh. Культивирование с целью изучения взаимного влияния микробов-ассоциантов проводили in vitro на модифицированной среде Surech (приоритетная справка № 2008115689).

Результаты исследований свидетельствуют о достаточно высокой встречаемости бактерий рода энетерококков у лиц инвазированных бластоцистами.

При изменении вирулентности бластоцист от LD₅₀/lg 0 до 5,3 ± 0,2 статистически достоверно резко изменялась обсемененность кишечника микробами Enterococcus faecflis. Значение их обсемененности изменялись от lg 3,1 ± 0,3 до lg 8,1 ± 0,3 КОЕ/г (р ≤ 0,001).

Проведенные исследования показали, что в ходе контакта Е.faecflis с бластоцистами отмечены изменения их патогенных свойств: усиление (синергизм), ослабление (антагонизм), и индифферентное влияние.

Синергизм при сокультивировании Е.faecflis и бластоцист проявляется в увеличении коэффициента гемолитической и колициногенной активностей бактерий до 6,6 ± 0,5 и 5,1 ± 0,21 ед соответственно (до сокультивирования - 1,5 ± 0,03 и 3,92 ± 0,13, в монокультурах - 1,7 ± 0,3 и 2,9 ± 0,13 ед соответственно, р ≤ 0,001).

В результате совместной инкубации простейших и бактерий изменилась так же чувствительность последних к антибактериальным препаратам у всех 66 штаммов (100%) (табл. 1). Усиление антибиотикорезистентности штаммов выделенных после совместного культивирования по отношению к культурам, выделенным из кишечника, произошло в 1,69 раза.

Изучение протеолитической активности энтерококков также выявило синергидное взаимодействие. До совместного культивирования данным видом активности обладали 32 культуры (52,31%), после - все 66 (100%), в монокультурах - 26 (20,77%). У всех изолированных Е.faecflis была изучена сахаролитическая активность, по отношению к следующим углеводам: лактоза, глюкоза, мальтоза, сахароза, фруктоза (табл. 1).

Как показано в табл. 1 после взаимодействия бактерий с бластоцистами in vitro сахаралитическая активность значительно снизилась.

Сравнительная характеристика чувствительности к антибиотикам штаммов Е.faecflis

Примечание: * - Р < 0,05; ** - Р ≤ 0,001.

Полученные данные свидетельствуют об антагонистическом воздействии простейших B.hominis на способность энтерококков гидролизовать углеводы (табл. 2).

Определение факторов патогенности Blastocystis hominis, показало синергидное взаимодействие бактерий и простейших, которое привело к усилению ДНК-азной, гемолитической, липазной, лецитоветилазной и протеолитической активностей.

Из 78 изолятов паразитов после совместной инкубации со штаммами Е.faecflis 58 культур (84,1%) приобрели способность разрушать эритроциты крови человека. Тогда как до инкубации данным свойством обладали только 26 штаммов (38,41%).

В монокультуре (табл. 2) способность разрушать эритроциты крови человека сохранили только 5 штаммов (4,6%). Коэффициент гемолитической активности штаммов простейших выделенных из кишечного микробиоценоза составил 1,48 ± 0,02 ед, культур из ассоциации с Е. faecflis после совместной инкубации повысился до 3,2 ± 0,02 (в монокульту- рах - 0,7 ± 0,1 ед, р ≤ 0,001).

Сравнительная характеристика сахаролитической активности Enterococcus faecalis
до и после совместного культивирования с B.hominis

Среди штаммов бластоцист, выделенных из консорциума после взаимодействия in vitro, ДНК-азной активностью обладали 62 культуры (97,3%), коэффициент ДНК-азной активности составил 4,7 ± 0,3 ед. В группе изолятов, изолированных из толстой кишки способность к разрушению ДНК выявили у 27 культур (90,1%), коэффициент активности равнялся 1,6 ± 0,2 ед., р ≤ 0,001. Из монокультур бластоцист только 9 (9,9%) характеризовались ДНК-азной активностью, коэффициент - 0,9 ± 0,4 ед. Изучение липолитической активности культур после сокультивирования показало увеличение значений коэффициентов до 5,7 ± 0,3 ед. (у штаммов, полученных до сокультивирования - 1,38 ± 0,5, из монокультуры - 0,5 ± 0,6 ед., р≤0,001).

Способность продуцировать лецитиназу также увеличивалась у простейших после совместного культивирования с бактериями Е.faecflis. Лецитоветилазная активность проявилась у 58 культур (96,7%), коэффициент активности составил 5,3 ± 0,2 ед. Коэффициент лецитоветилазной активности штаммов бластоцист, изученных до совместного культивирования, равнялся 1,69 ± 0,5 ед., у бластоцист из монокультуры - 0,8 ± 0,4 ед., р ≤ 0,001.

Заключительным этапом исследований, посвященных изучению факторов патогенности, простейших-ассоциантов явилось определение протеолитических ферментов. Как показали исследования 74 культуры бластоцист в результате взаимодействия с Е.faecflis in vitro (49,0%) приобрели способность гидролизовать молочный белок. Из группы бластоцист, выделенных из ассоциаций толстой кишки, данной способностью характеризовались 39 изолятов (25,83%), у бластоцист из монокультуры протеолитической активностью обладали 13 штаммов (8,6%).

Таким образом, в ходе межмикробных взаимодействий ассоциативных микросимбионтов синергизм проявлялся в усилении гемолитической, колициногенной, протеолитической активностей и антибиотикорезистентности со стороны бактерий и увеличении гемолитической, ДНК-азной, протеолитической, лецитоветилазной, липолитической активностей со стороны Blastocystis hominis. Антогонизм - только в отношении сахаролитической способности бактерий.

• Ильина Н.А., д.б.н, профессор кафедры зоологии, проректор по научной работе ФГБОУ ВПО УЛГПУ им. И.Н. Ульянова, г. Чебоксары;
• Нестеров А.С., д.м.н., профессор кафедры инфекционных и кожно-венеро­логи­чес­ких болезней ФГБО УВПО УлГУ, г. Волгоград.

Работа поступила в редакцию 25.04.2012