Гипоксия представляет собой универсальный патологический процесс, который сопровождает и определяет возникновение большинства сердечно-сосудистых заболеваний. Развитие сердечно-сосудистых событий предусматривает как периоды кислородного голодания в ишемизированных участках тканей, так и последующее восстановление кровотока - реперфузию. При этом нарушение кровоснабжения в период гипоксии и последующая реоксигенация приводят к изменениям состояния эндотелиальных клеток (ЭК), которые правильнее рассматривать как систему эндотелиальных клеток, способную к саморегуляции в ответ на изменения условий среды [5]. Известно, что временная гипоксия способна вызывать активацию эндотелия [4, 10], а резкое повышение содержания кислорода (реоксигенация), может оказывать как повреждающее [3, 9], так и активирующее [6, 10] действие на эндотелиальные и прочие типы клеток. Возможность стимуляции апоптотических изменений культивируемых эндотелиоцитов в ответ на гипоксию и реоксигенацию освещалась многими авторами. К сожалению, данные, получаемые при изучении влияния различных концентраций кислорода на пролиферативную активность и апоптоз эндотелиальных клеток малочисленны и противоречивы в силу отличия режимов проводимых экспериментов, что приводит к необходимости дальнейшего изучения данного вопроса.
Цель исследования - изучить динамику пролиферативной активности и апоптотических изменений эндотелиальных клеток человека в условиях гипоксии и последующей реоксигенации.
Материал и методы исследования
Эндотелиальные клетки из пупочной вены человека (HUVEC) выделяли согласно адаптированному протоколу Jaffe et all. (1973 г.) Последующее культивирование клеток проводили с использованием наборов Endothelial Cell Cultur Medium Kit (BD Bioscience, США). В эксперименте использовали культуру HUVEC 2 пассажа, предварительно протестированную на предмет присутствия бактериальных и вирусных ДНК, способных влиять на клеточную пролиферацию. Тестирование на микоплазму, уреаплазму, цитомегаловирус, вирус папилломы человека высокого канцерогенного риска (тип 16, 18), вирус простого герпеса I и II типов проводили методом ПЦР на детекторе ДТ 96 (Россия) в режиме реального времени с использованием реагентов фирмы «Амплисенс» (Россия).
Различные модели гипоксии ((10% О2, 5% СО2, 85% Ar) и (5% О2, 5% СО2, 90% Ar)) создавали в условиях мультигазового биореакторного комплекса (ООО «Саяны», Россия) в непрерывном 3-суточном режиме с использованием автоматической коррекции газового состава через каждые 2 мин и поддержанием температуры в колбах биореактора 37°С. Культуру HUVEC для каждого эксперимента высевали в количестве 2·105 в три 6-луночные планшета, предварительно покрытые раствором коллагена I типа в концентрации 100 мкг/мл, и помещали их в первую колбу биореактора. Во вторую колбу помещали три 96-луночных планшета, лунки которых предварительно были покрыты коллагеном I типа в вышеуказанной концентрации и засеяны эндотелиальными клетками в количестве 0,1·105. После герметизации колб запускали биореактор. Отсчет времени гипоксического воздействия начинали с момента стабилизации задаваемого газового состава (в среднем, через 1,5 часа). Через каждые сутки из колб биореактора изымали по одному 6-луночному и 96-луночному планшету для последующего подсчета клеток, их фенотипирования, определения жизнеспособности, пролиферативной активности как после проведенной гипоксии, так и в условиях последующей реоксигенации. Смену среды в оставшихся 96-луночных планшетах проводили ежедневно, в 6-луночных - 1 раз в 3 дня.
Подсчет эндотелиальных клеток после снятия с поверхности культурального пластка 0,5% раствором трипсина (Sigma Aldrich, США) проводили в камере Горяева. Фенотип снятых HUVEC определяли методом проточной цитофлуориметрии на цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с использованием моноклональных антител CD146 и CD34 (BD Biosciences, США), меченных флуорохромами. Жизнеспособность HUVEC оценивали методом проточной цитофлуориметрии по содержанию клеток в состоянии апоптоза и некроза относительно всей популяции. Для этой цели использовали комбинированную окраску: Annexin V, меченый PE, и ДНК-связывающий краситель 7AAD (BD Biosciences, США). Клетки в состоянии апоптоза определялись за счет высокоафинного связывания Annexin V-РЕ с фосфатидилсерином, появляющегося на внешнем монослое цитоплазматической мембраны. Дополнительная окраска 7-AAD позволила выделить раннюю и позднюю стадию клеточного апоптоза и идентифицировать некроз.
Оставшуюся часть снятой после гипоксии культуры HUVEC высевали в три покрытых коллагеном I типа 96-луночных планшета для проведения МТТ-теста колориметрическим способом с оценкой результатов через 24, 48 и 72 часа после культивирования в условиях СО2-инкубатора при 20% О2, 5% СО2 и 37°С. МТТ-тест проводили с использованием MTT Cell Proliferation Assay Kit (Invitrogen, США). Для определения пролиферативной активности эндотелиальных клеток в условиях гипоксии через 1, 2 и 3 сут из второй колбы биореактора вынимали по одному 96-луночному планшету с HUVEC и проводили МТТ-тест. Один стрип выступал в качестве контроля культуральной среды и не содержал HUVEC. Оценку результатов МТТ-теста осуществляли с помощью вычисления коэффициента пролиферации (КП) по формуле:
КП = ОПопыт/ОПконтроль,
где ОПопыт - это оптическая плотность экстракта красителя, поглощенного эндотелиальными клетками в ходе МТТ-теста; ОПконтроль - это оптическая плотность красителя, содержащегося после МТТ-теста в лунках с культуральной средой без клеток.
Анализируемые показатели имели ненормальное распределение, поэтому достоверность различий определяли с помощью непараметрических критериев. Для оценки достоверности различий трех и более показателей внутри одной группы использовали критерий Фридмана, при проведении попарных сравнений - критерий Вилкоксона с поправкой Бонферрони. При сравнении двух несвязанных групп (показатели при нормоксии и гипоксии) использовали U-критерий Манна-Уитни, при сравнении трех несвязанных групп (эффекты гипоксии и реоксигенации по сравнению с нормоксией) - критерий Крискала - Уоллеса. Данные представляли как медиана и квартильный размах (Ме (25%; 75%)). При всех видах статистического анализа учитывался уровень статистической значимости 95% (р < 0,05). Статистическую обработку данных проводили с помощью программы «Statistica 6.0».
Результаты исследования и их обсуждение
Используемая в эксперименте культура HUVEC была свободна от бактериальных и вирусных ДНК, что подтверждено методом ПЦР. Перед культивированием в условиях гипоксии и нормоксии количество жизнеспособных эндотелиальных клеток составило 93,5%, в раннем апоптозе пребывали 3,15% клеток, в позднем апоптозе - 2,79%, в некрозе - 0,56% HUVEC. Из числа жизнеспособных ЭК 97,7% имели фенотип CD 146+, CD 34-. В процессе 3-дневного культивирования HUVEC при 20% О2 клеточный фенотип и количество жизнеспособных клеток достоверно не менялись. Снижение концентрации кислорода от 10 до 5% в процессе культивирования также не привело к изменению клеточного фенотипа и процента жизнеспособных эндотелиоцитов (93,5% при 20% О2 до 92,9% - при 5% О2), однако способствовало увеличению процента клеток, пребывавших в состоянии некроза за счет практически полного исчезновения HUVEC в состоянии раннего апоптоза (рис. 1).
Рис. 1. Изменение частоты клеточного апоптоза и некроза в зависимости от условий культивирования эндотелиальных клеток: * - p < 0,05 - достоверность различий показателей
Так, частота возникновения раннего апоптоза среди ЭК, культивированных при 5% О2, сократилась в 13 раз по сравнению с таковой при использовании 20% О2 (р < 0,01). Однако доля некротизированных ЭК нарастала при снижении концентрации кислорода, достигнув максимума в процессе культивирования клеток при 5% О2, когда относительное число эндотелиоцитов в некрозе было в 9 раз больше, чем при стандартных условиях культивирования (р < 0,01). При этом относительное число ЭК в позднем апоптозе при различных режимах оксигенации оставалось практически неизменным. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, демонстрировавших подавление процессов апоптоза в условиях гипоксии как на модели эндотелиоцитов, так и на примере других типов клеток [1, 2, 6], который может быть связан с активацией синтеза ряда антиапоптотических белков [7, 8]. Превалирование процессов некроза над процессами апоптоза при усугублении гипоксии можно объяснить тем, что процесс запрограммированной гибели клеток в отличие от некроза сопровождается энергетическими затратами, что является в условиях гипоксии нерациональным либо невозможным за счет существующего у ЭК энергодефицита.
При изучении динамики клеточной пролиферации в различных режимах оксигенации выявлено, что общее количество HUVEC, культивированных при 20% О2, увеличилось в 1,5, 1,8 и 2,9 раза через 1, 2 и 3 сут соответственно. При этом КП достоверно вырос лишь через 3 сут, превысив в 1,5 раза таковой через сутки (таблица).
Общее количество HUVEC и коэффициенты пролиферации (КП) в различные временные интервалы культивирования
при 20% О2, 10% О2 и 5% О2
|
|
Через 1 сутки (n = 6) |
Через 2 сут (n = 6) |
Через 3 сут (n = 6) |
|||
|
Количество HUVЕС, ·105 Ме(25%;75%) |
КП Ме (25%;75%) |
Количество HUVEC,·105 Ме(25%;75%) |
КП Ме (25%;75%) |
Количество HUVEC, ·105 Ме(25%;75%) |
КП Ме (25%;75%) |
|
|
20% О2 |
3,0(3,0; 3,1) |
2,2(2,1; 2,2) |
5,5(5,0; 6,0)* |
1,9(1,9; 2,2) |
15,8(15,3;16,3)* |
2,8(2,4; 3,1)* |
|
10% О2 |
3,0(2,9; 3,1) |
2,0(1,9; 2,0) |
7,9(7,8; 8,0)* |
3,0(2,9; 3,0)*/** |
17,9(17,2; 18,5)* |
3,5(2,2; 3,5) |
|
5% О2 |
2,6(2,5; 2,7) |
1,8(1,5; 1,9) |
10,3(8,8; 11,8)*/** |
3,5(3,0; 3,9)*/** |
14,1(13,3; 15,0) |
3,4(3,4; 3,6) |
Примечания:
* - достоверность отличий показателя с предшествующим значением в одной группе, р < 0,05; ** - достоверность отличий с подобным показателем в группе с 20% О2; р < 0,05.
В процессе культивирования HUVEC в условиях 10% О2 общее количество клеток увеличивалось пропорционально времени культивирования и через каждые сутки превышало предыдущее значение в среднем в 2,5 раза (р < 0,05). При этом нарастание клеточной массы коррелировало с увеличением коэффициентов пролиферации лишь до 2-дневного срока, когда КП в 1,5 раза превысил предыдущий аналогичный показатель (р < 0,05).
При культивировании HUVEC в присутствии 5% О2 максимальное увеличение числа клеток отмечено к окончанию 2 сут, превысив в 4 раза количество ЭК, полученное спустя 1 сутки (р < 0,05). Однако через 3 сут культивирования HUVEC при 5% О2 клеточная пролиферация заметно снизилась, превысив предыдущие значения всего на 40%. Эта динамика сопровождалась увеличением в 2 раза КП к концу 2 сут (р < 0,05) с последующим отсутствием изменений данного показателя.
Как видно из полученных результатов, общее количество ЭК в разные периоды используемых режимов культивирования не всегда коррелировало с динамикой соответствующих КП. Диссонанс между полученными результатами можно объяснить тем, что МТТ-тест больше отражает метаболическую активность митохондриальных ферментов популяции клеток, которая может хорошо соотноситься с их количеством. При культивировании клеток в «гипоксических» условиях весьма вероятна значительная перестройка метаболизма и в первую очередь его «энергетической составляющей». Представляется возможным, что одинаковое количество HUVEC, являющихся высокофункциональным типом клеток, может демонстрировать различную активность митохондриальных ферментов при разной концентрации кислорода.
При сравнении пролиферативной активности ЭК, культивируемых в разных режимах оксигенации, выявлено, что 2-суточное пребывание клеток как при 10% О2, так и при 5% О2 способствовало достоверному увеличению их КП (в 1,6 и 1,8 раза, соответственно; р < 0,05) в сравнении с КП HUVEC, культивируемых в стандартных условиях (20% О2), с нивелированием достоверных отличий между группами к окончанию 3 сут. Подобное стимулирование пролиферативного ответа клеток в условиях гипоксии может быть связано со снижением окислительного стресса, в котором оказываются клетки в процессе культивирования при 20% О2. Известно, что концентрации кислорода меньше 10% являются наиболее приближенными к таковым in vitro, способствуют меньшему напряжению антиоксидантных механизмов и, как следствие, способны приводить к стимуляции клеточной пролиферации на начальных этапах культивирования.
Рис. 2. Изменение пролиферативных индексов эндотелиальных клеток при реоксигенации, предварительно культивированных в разных режимах гипоксии: горизонтальная черта - контрольный уровень, за который принят КП HUVEC после 3 суток культивирования при 20% О2;
1 - КП HUVEC через 72 часа реоксигенации после 1 суток культивирования при 10% О2;
2 - КП HUVEC через 72 часа реоксигенации после 2 суток культивирования при 10% О2;
3 - КП HUVEC через 72 часа реоксигенации после 3 суток культивирования при 10% О2;
4 - КП HUVEC через 72 часа реоксигенации после 1 суток культивирования при 5% О2;
5 - КП HUVEC через 72 часа реоксигенации после 2 суток культивирования при 5% О2;
6 - КП HUVEC через 72 часа реоксигенации после 3 суток культивирования при 5% О2;
* - достоверность различий между показателями и контролем, р < 0,05
Отмечено, что увеличение сроков культивирования ЭК в условиях гипоксии стимулировало пролиферацию данной культуры при последующей реоксигенации. Так, максимальная и достоверная активация пролиферативной активности ЭК при реоксигенации в течение 72 ч наблюдалась только после 3-дневного предварительного воздействия на клетки 10% О2, тогда как схожий результат после воздействия 5% О2 был получен уже после 1 сут (рис. 2).
При этом коэффициенты пролиферации эндотелиоцитов через 72 часа реоксигенации были в 1,5 раза выше ((4,22(3,46; 4,58)) после 3 суток 10% О2 и ((4,34(4,16; 4,51)) после 1 суток 5% О2), чем КП HUVEC, культивируемых в течение 3 суток при 20% О2 (2,84(2,4; 3,09)), р < 0,05. Предшествуюшая 3-дневная гипоксия с использованием 5% О2 увеличила КП HUVEC в условиях 72-часовой реоксигенации в 1,8 раза по сравнению с 3-дневным культивированием в стандартных условиях ((5,26(4,63; 5,44)) после 3 суток 5% О2 в сравнении с (2,84(2,4; 3,09)) после 3 суток 20% О2; р < 0,05) .Заключение
Суммируя полученные результаты, следует отметить, что снижение содержания кислорода до 5% при 3-дневном культивировании эндотелиальных клеток увеличивает их пролиферативную активность и не снижает количества жизнеспособных клеток, однако способствует переключению клеточной гибели с апоптоза на некроз. Отмечено стимулирующее влияние предшествующей гипоксии на пролиферативную активность HUVEC в условиях реоксигенации. При этом максимальный эффект получен при использовании 5% О2.
Рецензенты:
-
Лисаченко Г.В., д.м.н., профессор, зав. кафедрой патологической физиологии ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, г. Кемерово;
-
Будаев А.В., д.м.н., доцент кафедры патологической физиологии ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, г. Кемерово.
Работа поступила в редакцию 03.07.2012.