К группе ферментов биотрансформации ксенобиотиков относятся ариламин N-ацетилтрансферазы: N-ацетилтрансфераза 1 (NAT1) и N-ацетилтрансфераза 2 (NAT2), осуществляющие N- и O-ацетилирование ароматических и гетероциклических аминов и гидразинов. NAT1 и NAT2 являются близкими по первичной структуре (79-95% гомологии аминокислотной последовательности, в зависимости от вида). Гены NAT хотя и расположены на одной хромосоме, но регулируются независимо друг от друга [8,9]. Данный фермент полиморфен, что фенотипически проявляется наличием в популяции «быстрых» и «медленных» ацетиляторов, при этом у представителей европеоидной расы частота «медленных» ацетиляторов составляет 40-60% [9]. Основной причиной изменения активности N-ацетилтрансферазы являются однонуклеотидные замены в структурной области гена NAT2. Самые распространённые мутации гена NAT2: в 481 позиции цитозин заменяется тимином (встречается в кластере аллелей NAT2*5 - NAT2*5A, NAT2*5B), в 590 позиции гуанин заменяется аденином (встречается в кластере аллелей NAT2*6 - NAT2*6A и NAT2*6B). Показано, что «быстрые» и «медленные» ацетиляторы имеют разную степень риска развития рака мочевого пузыря и молочной железы, диабета, системной красной волчанки и других заболеваний [7].
С конца 80-х годов начали идентифицировать аллельные варианты гена NAT2, носительство которых приводит к «медленному» ацетилированию. Известно около 20 мутантных аллелей гена NAT2, все они наследуются по аутосомно-рецессивному типу. Для европейской популяции наиболее распространенными мутантными аллелями являются NAT2*5B и NAT2*6А. Аллель NAT2*5B образуется сочетанием трех точечных мутаций: 341T → C, 481С → T, 803A → G; аллель NAT2*6А - сочетанием двух: 282C → T, 590G → A. Оба варианта составляют до 70-75% всех аллелей NAT2 и около 95% всех мутантных аллелей у европейцев, японцев и испанцев. Под руководством С.Ш. Сулейманова изучается роль фенотипа скорости ацетилирования в патогенезе различных заболеваний, а также различия в частотах фенотипов скорости ацетилирования в разных этнических группах коренных народов Крайнего Севера и Дальнего Востока [5]. По результатам генетического исследования жителей г. Москвы, исследователи сделали вывод о том, что распространенность «медленных» и «быстрых» ацетиляторов статистически значимо не отличается и составляет 47 и 44% соответственно [2].
Доказано, что артериальная гипертензия (AГ) является одним из важнейших факторов риска развития атеросклероза. Несмотря на то, что известно уже более двухсот факторов, способных влиять на возникновение и течение атеросклероза, основными считаются АГ, гиперхолестеринемия и курение («большая тройка») [1]. Нарушения липидного состава крови обнаруживаются у 40-85% больных с АГ. Следует помнить, что повышение холестерина на 1% приводит к увеличению риска развития ишемической болезни сердца на 2%. У больных АГ наблюдается дислипидемия, проявляющаяся в увеличении концентрации липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и снижении уровня липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) [4].
Цель исследования - проанализировать ассоциацию полиморфных вариантов гена NAT2 со степенью артериальной гипертензии и концентрацией общего холестерина в крови.
Материалы и методы исследования
Исследованы образцы ДНК 50 больных АГ без ассоциированных клинических состояний (28 женщин и 22 мужчины) в возрасте от 20 до 59 лет. Проводилось общепринятое клинико-инструментальное обследование больных, а также ряд дополнительных генетических и биохимических анализов. Изучались аллельные варианты гена NAT2 (NAT2*5A, NAT2*5B, NAT2*6А, NAT2*6B, NAT2*7B), приводящие к «медленному» ацетилированию. Пациенты по степени АГ были разделены на 3 группы: 1 группа - больные с I степенью АГ (21 человек); 2 группа - больные со II степенью АГ (13 человек); 3 группа - больные с III степенью АГ (16 человек).
При определении степени АГ руководствовались следующими уровнями систолического артериального давления (САД) и диастолического (ДАД), согласно рекомендациям Всероссийского научного общества кардиологов от 2010 г.: I степень - 140-159/90-99 мм рт. ст., II степень - 160-179/100-109 мм рт. ст., III степень - > 180/ > 110 мм рт. ст. АГ устанавливалась при стабильном повышении САД > или = 140 мм рт. ст. и/или ДАД > или = 90 мм рт. ст. по данным не менее чем двукратных измерений АД по методу Н.С. Короткова при трех последовательных визитах с интервалом не менее одной недели у лиц, не принимающих антигипертензивных препаратов.
Использовался один из самых эффективных на сегодняшний день методов генетического тестирования - исследование на гидрогелевых биочипах. Методика, разработанная в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, основана на гибридизации в микроячейках биологического чипа. Технология анализа генетического полиморфизма предполагает мультиплексную амплификацию фрагментов ДНК с использованием флуоресцентно меченых праймеров и добавление меченого продукта на микробиочип, где происходит его гибридизация с иммобилизированными в геле зондами. Ячейки с зондами располагаются на планшете в несколько рядов, и каждая ячейка содержит уникальный индивидуальный зонд, являясь микропробиркой для проведения реакции. Число гелевых ячеек и их расположение на подложке зависит от задач и условий планируемого эксперимента. Компьютерная программа вычисляет интенсивности флуоресцентных сигналов в ячейках и определяет, в каких ячейках образовались устойчивые комплексы. Детектор выдает отчет о наличии в исследуемом образце специфичной мишени. Данный метод позволяет анализировать до 50 полиморфных вариантов с точностью более 99% [3]. (Возможность изучения полиморфизмов на чипах в ходе исследования предоставлена ООО «Геночип» г. Саратов). В качестве биологического материала использовалась периферическая кровь. Весь материал был собран с соблюдением процедуры информированного согласия пациентов. ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с помощью набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) в соответствии с инструкцией производителя.
Определение уровня общего холестерина проводилось с помощью энзиматического фотометрического теста «CHOD-PAP» - определение холестерина ферментативным гидролизом и окислением [6]. Согласно европейским рекомендациям уровень общего холестерина менее 5,2 ммоль/л считался желаемым или нормальным; от 5,2 до 6,5 ммоль/л - легкой гиперхолестеринемией; от 6,5 до 7,8 ммоль/л - умеренной гиперхолестеринемией; 7,8 ммоль/л и выше - выраженной гиперхолестеринемией.
Выявление зависимости уровня холестерина от аллельных вариантов гена NAT2 проводилось с помощью корреляционного анализа Кендалла. Оценка статистической значимости различий долей (частот встречаемости) выполнялась на основе критерия χ2.
Результаты исследования и их обсуждение
В таблице представлено распределение аллельных вариантов гена NAT2 у больных с разной степенью АГ. Из обследованных пациентов с I степенью АГ «медленными» ацетиляторами (гомозиготами по мутантному варианту гена NAT2) явились: по аллельным вариантам NAT2*5A (341Т → С и 481С → Т) - 43%, по аллельным вариантам NAT2*5B (341Т → C, 481С → Т, 803А → G) - 57%, по аллельным вариантам NAT2*6А (282С → Т, 590G → А) - 52%, по аллельным вариантам NAT2*6В (590G → A) и NAT2*7В (282С → Т, 857G → A) - 29%.
Распределение гомозигот по мутантным аллельным вариантам гена NAT2 у больных АГ
|
Степень АГ |
NAT2*5A |
NAT2*5B |
NAT2*6A |
NAT2*6B |
NAT2*7B |
|||||
|
341Т-С |
481С-Т |
341Т-С |
481С-Т |
803А-G |
282C-T |
590G-A |
590G-A |
282C-T |
857G-A |
|
|
I степень n = 21 |
С/С - 6 |
Т/Т-3 |
С/С -5 |
Т/Т-6 |
G/G-1 |
Т/Т- 7 |
А/А-4 |
А/А-3 |
Т/Т-2 |
А/А-1 |
|
II степень n = 13 |
С/С - 2 |
Т/Т-4 |
С/С-2 |
Т/Т-5 |
G/G-4 |
Т/Т-0 |
А/А-3 |
А/А-2 |
Т/Т-3 |
А/А-2 |
|
III степень n = 16 |
С/С - 2 |
Т/Т-0 |
С/С-3 |
Т/Т-2 |
G/G-1 |
Т/Т-1 |
А/А-0 |
А/А-1 |
Т/Т-1 |
А/А-0 |
Примечание: данные представлены в абсолютном количестве пациентов (n). Знак «→» в заголовках столбцов таблицы заменен на «-».
У пациентов со II степенью АГ распределение генотипов несколько отличалось: NAT2*5A (341Т → С и 481С → Т) - 46%, NAT2*5B (341Т → C, 481С → Т, 803А → G) - 85%, NAT2*6А (282С → Т, 590G → А) - 23%, NAT2*6В (590G → A) и NAT2*7В (282С → Т, 857G → A) - 54%.
Среди больных III степенью АГ распределение генотипов по аллельным вариантам было следующим: NAT2*5A (341Т → С и 481С → Т) - 13%, NAT2*5B (341Т → C, 481С → Т, 803А → G) - 38%, NAT2*6А (282С → Т, 590G → А), NAT2*6В (590G → A) и NAT2*7В (282С → Т, 857G → A) - 19%.
Холестерол - стероид, характерный только для животных организмов. Он синтезируется во многих тканях человека, но основное место синтеза - печень. В печени синтезируется более 50% холестерола, в тонком кишечнике до 15-20%, остальной холестерол синтезируется в коже, коре надпочечников, половых железах. В сутки в организме синтезируется около 1 г холестерола; с пищей поступает 300-500 мг. Процесс синтеза холестерола включает 35 стадий, основными из которых являются превращение активного ацетата в мевалоновую кислоту, образование изопентенилдифосфата, образование сквалена, циклизация сквалена в холестерин. Ацетил-КоА - макроэргический продукт конденсации коэнзима-А с уксусной кислотой. Именно в форме ацетил-КоА уксусная кислота участвует в синтезе холестерина. Кофермент А (КоА) - кофермент ацетилирования (один из важнейших коферментов); принимает участие в реакциях переноса ацильных групп. КоА действует в качестве промежуточного звена, связывающего и переносящего кислотные остатки на другие вещества. Обмен холестерола чрезвычайно сложен, для его синтеза необходимо осуществление нескольких десятков последовательных реакций. Нарушения обмена холестерола приводят к одному из наиболее распространённых заболеваний - атеросклерозу [1].
Одним из наиболее значимых исследований, показавших связь между уровнем общего холестерина крови и сердечно-сосудистой смертностью больных АГ, является Multiple Risk Factor Intervention Trial (MRFIT) [10]. Его результаты показали: чем выше уровень холестерина у пациентов с артериальной гипертензией, тем выше сердечно-сосудистая смертность. Вместе с тем при одном и том же уровне холестерина смертность больных в связи с ишемической болезнью сердца была в 3-4 раза выше при наличии АГ по сравнению с лицами, не страдающими АГ.
Результаты нашего исследования показали (см. таблицу), что среди больных с I степенью АГ чаще встречаются гомозиготы по следующим аллельным вариантам: NAT2*5A (341Т → С и 481С → Т), NAT2*5B (341Т → C, 481С → Т) и NAT2*6А (282С → Т, 590G → А). Среди изученных мутаций у больных со II степенью АГ интерес, по нашему мнению, представляют следующие: 481С → Т гена NAT2*5А, 481С → Т и 803А → G гена NAT2*5B. «Медленные» аллельные варианты по указанным генам встречались в исследуемых образцах чаще других. Значительно реже гомозиготы по изучаемым аллельным вариантам «медленного» ацетилирования наблюдались у больных с III степенью АГ.
Ферментативный анализ показал, что 52% (26 чел.) обследуемых больных АГ имели нормальный уровень холестерина (менее 5,2 ммоль/л); при этом статистически значимо (p < 0,05) большинство из них имели I степень АГ (рисунок). У 30% (15 чел.) больных содержание холестерина в крови имело значения в диапазоне от 5,2 до 6,5 ммоль/л, при этом в данной категории в более-менее равной мере представлены пациенты всех трех степеней АГ (см. рисунок). У 18% (9 чел.) пациентов выявлялся уровень холестерина более 6,5 ммоль/л; большинство из них имели III степень АГ (статистически значимых различий в группе выявлено не было по причине малого числа наблюдений) (рисунок).
Распределение частоты встречаемости трех степеней АГ в подгруппах пациентов с различным уровнем общего холестерина крови. Примечание: статистическая значимость отличий по частоте встречаемости от пациентов с АГ 1 степени представлена на уровне p < 0,05 (*) и p < 0,01 (**)
Изучение зависимости уровня холестерина от аллельных вариантов гена NAT2 позволило выявить статистически значимую слабую связь между содержанием холестерина и аллельными вариантами генов NAT2*5A (r = 0,172, р < 0,05), NAT2*5B (r = 0,186, р < 0,05) и NAT2*6А (r = 0,25, р < 0,05).
Мы полагаем, что мутации гена NAT2, приводящие к медленному ацетилированию, нарушают процесс синтеза холестерола. Нами было показано, что генетические гомозиготные мутации, обусловливающие медленное ацетилирование, в исследуемой группе пациентов чаще выявляются при I и II степени АГ, что согласуется с выявленной ассоциацией повышенного уровня общего холестерина с увеличением степени АГ (r = 0,39, p < 0,001) (см. рисунок). Очевидно, что уровень общего холестерина в крови больных АГ так или иначе зависит от аллельных вариантов гена NAT2.
Заключение
«Медленные» аллельные варианты гена NAT2 способствуют снижению уровня фермента N-ацетилтрансферазы, замедляя реакцию превращения Ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА и нарушая многоэтапную цепь синтеза холестерола. В нашем исследовании показано, что у больных АГ наличие указанных генетических мутаций в определенной мере ассоциировано с уровнем общего холестерина. Мутации гена, кодирующего фермент N-ацетилтрансферазу, нарушая синтез холестерина, могут существенно снижать риск развития кардиоваскулярных осложнений у больных АГ. Однако у пациентов с III степенью АГ частота встречаемости подобных «благоприятных» мутаций низка, что способствует, в совокупности с другими фактора- ми, более частому развитию гиперхо- лестеринемии.
Таким образом, представляет интерес дальнейшее изучение молекулярно-генетических связей между «медленными» аллельными вариантами гена NAT2 (с использованием методики гидрогелевых биочипов) и уровнем холестерина у больных АГ, а также их влияния на прогноз течения заболевания.
Рецензенты:
-
Пучиньян Д.М., д.м.н., профессор, заместитель директора по научной работе ФГБУ «Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Минздравсоцразвития России, г. Саратов;
-
Коршунов Г.В., д.м.н., профессор, главный научный сотрудник отдела лабораторной и функциональной диагностики ФГБУ «Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Минздравсоцразвития россии, г. Саратов.
Работа поступила в редакцию 31.05.2012.