Ганглиозные клетки - эффекторные элементы сетчатки, транслирующие нервный импульс в зрительные центры мозга. В эмбриогенезе ганглиозные клетки дифференцируются первыми, а как самостоятельная структура, ганглиозный слой обособляется на 13-й неделе развития [3, 9]. В развивающейся сетчатке закладывается избыточное количество нейронов, основная масса которых подвергается апоптозу. Так, у плодов человека популяция ганглиозных клеток составляет 2,2-2,5 миллиона на 18-30 неделях развития, а к моменту рождения их количество снижается до 1,5-1,7 миллиона [13]. У человека пик физиологической гибели нейронов приходится на третий триместр беременности и именно в этот период происходит становление основного порядка внутри- и межслойных связей между локальными нейронами сетчатки [5, 8].
Цель настоящей работы состояла в исследовании количественных показателей популяционного состава ганглиозного слоя сетчатки на разных стадиях апоптотического процесса в эмбриогенезе человека.
Материал и методы исследования
Исследовали сетчатку 6 глаз от трех плодов человека 11-12 недель развития, 5 глаз от трех плодов 20-21 недель развития и 2 глаз от одного плода 30-31 недель развития. Плоды I триместра беременности получали при медицинских абортах, II триместра - в результате самопроизвольного выкидыша и аборта, проведенного по медицинским показаниям (экстрагенитальное заболевание матери), III триместра - в результате интранатальной смерти плода (асфиксия) без врожденных пороков развития.
Глаз извлекали на стекло, промывали дистиллированной водой и разрезали по лимбу. После удаления стекловидного тела сетчатку отделяли от задней стенки глаза с помощью кисти и стеклянных палочек, помещали в холодный 4% раствор параформальдегида, приготовленного на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) и фиксировали в течение 3-4 ч при 4°С.
В качестве специфической пробы на ДНК использовали метод Фельгена и Россенбекка. Исследования проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином и по методу Ниссля. Апоптоз изучали с помощью иммуноцитохимического метода TUNEL, основанного на выявлении фрагментированных цепочек ДНК [11].
Апоптотический индекс (АИ) определяли как отношение общего числа TUNEL-позитивных ядер (NTUNEL) к количеству клеток, окрашенных толуидиновым синим и имеющих видимое непикнотизированное ядро (NТ) по формуле АИ = (NTUNEL×100)/NТ [2]. Данные обрабатывали методом вариационной статистики. Различия оценивали по критерию Стьюдента и считали значимыми при P < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Ганглиозный слой сетчатки человека дифференцируется на 13-й неделе беременности. К моменту рождения ганглиозные клетки достигают полной морфологической зрелости. Их положение неравномерно в различных зонах сетчатки и уменьшается от центра к периферии. В течение плодного периода она неизменно снижается (таблица). В I триместре (10-11 неделя) преобладают клетки с четко дифференцированным округлым ядром, содержащим конденсированный хроматин. Также встречаются ядра с нарушением структуры и локализации хроматина. Среди них можно выделить четыре основные типа.
Морфологическая характеристика ганглиозного слоя сетчатки человека
|
Триместры |
Плотность расположения ганглиозных клеток в 1 мм2 |
Ширина ганглиозного слоя (мкм)* |
Апоптотический индекс (%) ** |
|
|
центральная сетчатка |
периферическая сетчатка |
|||
|
I II III |
683 ± 18 537 ± 12 371 ± 11 |
394 ± 11 213 ± 12 109 ± 5 |
199,4 ± 6,1 127,9 ± 4,9 79,3 ± 3,72 |
1,31 ± 1,3 2,23 ± 1,1 4,04 ± 1,2 |
Примечания:
* - данные относятся к среднепериферической части сетчатки;
** - данные относятся к центральной части сетчатки.
Первый тип клеток содержит интенсивно окрашенные глыбки хроматина, локализованные на полюсах ядра, при этом центральная часть ядра оставалась светлой. У второго типа клеток ядра светлые, набухшие, содержат слабо базофильный диспергированный хроматин. Ядра третьего типа имеют хорошо контурированную кариолемму и редкие мелкодисперсные зерна хроматина по ее периметру. Центральная часть ядра выглядит оптически пустой. Ядра четвертого типа пикнотические, интенсивно базофильные, с плотным хроматином, занимающим все ядро. Такие ядра встречались очень редко.
При реакции на ДНК по методу Фельгена-Россенбекка ядра с четкими границами и различной плотностью хроматина встречались реже, чем на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. При этом в одних ядрах хроматин в виде глыбок лежал на полюсах, в других - распределялся более или менее равномерно по всей кариоплазме. Встречались ядра, где хроматин занимал часть ядра и располагался в виде полулуний.
Ширина ганглиозного слоя колебалась в пределах 79,69-349,36 мкм и в среднем составляла 199,44 ± 6,1 мкм. Подсчет концентрации клеточных элементов на 1 мм2 показал, что при реакции на ДНК их количество составило 312 ± 9. У плодов II триместра (20-21 неделя) при окраске гематоксилином и эозином в ганглиозном слое встречались клетки с округлыми и овальными ядрами неодинаковой величины и с разной плотностью хроматина. По сравнению с I триместром количество нейронов в ганглиозном слое значительно сократилось. У некоторых нейронов ядра довольно крупные, округлые, с низкой плотностью хроматина. Изредка регистрировались клетки с набухшими ядрами и со значительным содержанием мелкодисперсного хроматина.
При окраске по методу Фельгена и Россенбекка ДНК-позитивные структуры располагались вдоль ядерной мембраны в виде кольца или полукольца. В некоторых клетках конденсированный хроматин занимал всю площадь ядра. Ширина ганглиозного слоя составляла 65,49-272,4 мкм, в среднем 127,9 ± 4,98 мкм, а концентрация клеток на 1 мм2 - 192 ± 8. У плодов III триместра (30-31 неделя) при окраске гематоксилином и эозином в ганглиозном слое идентифицировались клетки с различной плотностью хроматина. При реакции на ДНК ганглиозный слой содержал клетки с мелкими гиперхромными и с крупными гипохромными ядрами. Ширина слоя колебалась в пределах 49,36-131,8 мкм и в среднем составляла 79,3 ± 3,72 мкм. Концентрация клеток на 1 мм2 - 108 ± 6 ядер.
На наших препаратах среди большинства нормальных ядер, содержащих равномерно рассеянный мелкозернистый хроматин, мы наблюдали ядра с нарушенной структурой и локализацией. В одних ядрах хроматин был собран в грубые глыбки, находящиеся на его полюсах. В других ядерный хроматин формировал сплошное кольцо по периметру кариолеммы. Центральная часть ядра выглядела оптически пустой. Встречались пикнотические ядра с конденсированным хроматином. Подобные изменения характеризовали раннюю стадию апоптоза. Также мы наблюдали апоптотические тельца, свидетельствующие о завершении процесса.
Активность апоптоза не одинакова на разных стадиях развития сетчатки. Самые высокие показатели апоптотического индекса регистрируются на 30-й неделе пренатальной жизни (см. таблицу). TUNEL-позитивные нейроны локализуются преимущественно в наружном подслое ганглиозного слоя, иногда объединяются в кластеры из 2-3 ядер. В глубоком подслое ганглиозного слоя TUNEL маркирует очень редкие единичные ядра апоптотических клеток. В этом случае ядра апоптотических нейронов выглядят как интенсивно окрашенные точки, которые, сливаясь, образуют кольца, полукольца, а также сплошные однородные конгломераты.
Заключение
В сетчатке человека выделяют два периода клеточной гибели. Первый период устанавливается на 14-16 день эмбриогенеза и совпадает с началом пролиферации, миграцией нейронов и прорастанием их первичных отростков [4, 6]. У мышей, по данным Valenciano с соавт. [14], это происходит на 15-17 день эмбриогенеза. Второй период естественной (физиологической) гибели нейронов сопряжен с анатомической перестройкой локальных систем нейроциркуляции между сетчаткой и ядрами мозгового ствола, а также переводом «молчащих» синапсов в функционирующие [7, 10].
Апоптоз синхронизирован с пролиферацией и миграцией постмитотических нейронов [12]. В плодном и постнатальном периодах развития апоптоз обусловлен специализацией синаптических мишеней и рассматривается как элемент пластичности формирующихся нервных связей [2, 7, 13]. Наши наблюдения показали, что количество апоптотических клеток преобладает в третьем триместре. Активация апоптоза перед рождением, очевидно, связана с развитием конкурентных отношений между развивающимися нейронами при формировании синапсов, то есть, нейроны, не способные устанавливать связи, подвергаются гибели [1, 7, 15].
Таким образом, созревание ганглиозных клеток включает период значительной апоптотической гибели, которую можно рассматривать как стадию развития сетчатки человека. Как основной механизм поддержания гистогенетического постоянства ганглиозного слоя, апоптоз обеспечивает отбор и элиминацию избыточно образованных нейронов, сокращает их содержание до физиологической нормы, способствует адекватному нейрогенезу, обеспечивает формирование дефинитивных нейронов и селекционирование межнейронных связей.
Рецензенты:
-
Дюйзен И.В., д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории фармакологии Института биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук, г. Владивосток;
-
Евдокимов В.В., д.б.н., профессор, заведующий сектором размножения промысловых гидробионтов ТИНРО-центра, г. Владивосток.
Работа поступила в редакцию 06.06.2012.