Особую роль в развитии повреждения миокарда при различных гормональных нарушениях играют полиморфноядерные лейкоциты (ПМЯЛ) и их лизосомы. Нейтрофилы, благодаря своей высокой чувствительности и лабильности, способны быстро и точно отражать не только разнообразные нарушения в организме, но также и процессы восстановления.
Важным компонентом кислород независимой биоцидности нейтрофильных гранулоцитов является лизосомальный аппарат клеток. Отсюда представлялось интересным и важным оценить активность лизосомального аппарата не только в миокарде, но, учитывая лейкоцитарную инфильтрацию сердечной мышцы, также и в лейкоцитах.
Цель - изучить особенности активации лизосомального аппарата и обмена микроэлементов у крыс при экспериментальном повреждении миокарда .Материалы и методы исследования
Экспериментальный окклюзионный инфаркт миокарда (ЭИМ) воспроизводился у крыс-самцов Вистар, массой 180-230 г. В опытах с ЭИМ использовано 36 животных. Контролем служили ложнооперированные (ЛО) - (15 крыс) и интактные (8 крыс) животные. Операция проводилась по методу Г. Селье с доступом по А.Х. Когану с соблюдением правил асептики и антисептики, под эфирным наркозом. Выживаемость животных после операции на протяжении всего исследования (14 суток) составила 50-60%.
Ложная операция повторяла все этапы создания ЭИМ за исключением перевязки левой коронарной артерии, вместо чего делали укол миокарда в области проекции данного сосуда. Выживаемость животных после ЛО составила 100%.
Сердечную мышцу подвергали гомогенизации. Для приготовления гомогената из ткани сердца последняя предварительно измельчалась ножницами, растиралась в ступке с истолченным стеклом и суспендировалась в 9 объемах 0,25 М раствора сахарозы с 0,001 М ЭДТА, рН 7,4. Стекло и оставшиеся неразрушенными соединительно-тканные элементы удаляли центрифугированием при охлаждении на центрифуге ЦЛР-31 (2000 об/мин×5 мин). Затем в супернатанте и в сыворотке крови определяли спектрофотометрическим методом активности лизосомальных ферментов (ЛзФ: кислая фосфотаза, ДНК-аза, катепсин D , β-галактозидаза).
Определение микроэлементов проводилось атомно-абсорбционным методом, который обладает рядом преимуществ (незначительное влияние солевого состава, почти полное отсутствие взаимных аберраций определяемых элементов). Как правило, заметные искажения вызывают только 100-1000-кратные превышения концентраций, образующие трудно диссоциируемые окислы, что делает этот метод предпочтительным для определения ряда элементов, в том числе микроэлементов.
Статистическая обработка полученных данных осуществлялась по общепринятым методикам пакетом прикладных программ Statistica 6.0, Microsoft Excel 7.0 на ПК PC Pentium (III)-650 МГц MMX.
Результаты исследования и их обсуждение
Лизосомы, рано и эффективно включающиеся в реализацию адаптивных реакций организма, при окклюзионной гипоксии, равно, как и при поломе гормональной регуляции могут освобождать активные кислые гидролазы в цитозоль и далее во внеклеточное пространство и циркулирующую кровь и тем самым инициировать процессы клеточного повреждения [1]. Действительно, биохимические исследования гомогената из ткани миокарда и сыворотки крови показали, что развитие некротических изменений в миокарде сопровождалось значительным повышением активности лизосомальных ферментов в органе c максимумом на 1-3-и сут- ки и в сыворотке крови. Как показали результаты, экспериментальный инфаркт миокарда (ЭИМ) у крыс сопровождался значительными, закономерными фазовыми изменениями активности лизосомальных кислых гидролаз в сердечной мышце и в сыворотке крови. Так, оказалось, что ЭИМ сопровождался умеренным увеличением активности кислой фосфатазы (КФ) и β-галактозидазы в сердечной мышце в 1-3-и сутки после операции. Эти величины мало отличались от активности соответствующих ферментов в гомогенате сердечной мышцы у ложнооперированных (ЛО) крыс. Однако в противоположность ЛО у животных с ЭИМ отмечалось резкое увеличение активности кислой ДНКза (более, чем в 5 раз) и катепсина D (более, чем в 18 раз в 1-е и почти в 8 раз на 3-и сутки), по сравнению с контролем. К 14 суткам ЭИМ активность всех измеряемых ферментов возвращалась к норме (табл. 1).
Развитие ЭИМ сопровождалось также закономерными изменениями активности лизосомальных ферментов в сыворотке крови. Так, через 1-3-и сутки после операции активность КФ более, чем в 10 раз превышала уровень активности у ЛО крыс, активность кислой ДНКзы - более чем в 6 раз, β-галактозидазы - почти в 3 раза. Выявлялась высокая активность катепсина D (10,86 ± 1,01 мкмоля тирозина/л сыворотки за 1 мин). На 14 сутки ЭИМ все еще оставалась повышенной активность кислой ДНК-азы и катепсина D, уровень активности остальных ферментов не отличался от величин, измеряемых у ЛО животных (см. табл. 1).
Таблица 1
Активность Лз ферментов в гомогенате сердечной мышцы у животных с ЭИМ (мкмоль/г белка/мин; n = 10; M ± m)
|
Ферменты |
Контроль |
1-е сут. после операции |
3-и сут. после операции |
14-е сут. после операции |
|
Β β-галактозидаза |
3,3 ± 0,09 |
8,6 ± 0,89* |
5,5 ± 0,43* |
2,2 ± 0,03 |
|
кДНКза |
3,9,0 ± 0,07 |
3,0 ± 0,02 |
2,8 ± 0,05 |
3,6 ± 0,07 |
|
КФ |
7,7 ± 0,26 |
1,3 ± 1,91* |
9,7 ± 1,37* |
3,0 ± 0,32 |
|
Кат.D |
0,64 ± 0,03 |
0,5 ± 0,03 |
0,4 ± 0,07 |
0,9 ± 0,11 |
Примечание. * достоверные отличия от уровня активности у ЛО животных (P < 0,05).
Микроэлементы являются коферментами самых различных ферментных систем, включая гидролазы, а также про- и антиоксидантные ферменты и, более того, активность данных ферментов напрямую зависит от содержания микроэле- ментов [2].
В динамике ЭИМ у крыс в 1-3-и сутки наблюдается повышение концентрации железа в сыворотке: на 3-и сутки данный показатель вырастает в 2 раза в сравнении с контролем. Однако самое выраженное повышение отмечается на 14-е сутки - практически в 5 раз! (табл. 2).
Таблица 2
Содержание железа и цинка в сыворотке крови у крыс с ЭИМ † (М ± m)
|
Сроки исследования |
Fe |
Zn |
|
Контроль |
0,42 ± 0,01 |
1,91 ± 0,01 |
|
1-е сутки |
0,80 ± 0,01*# |
1,0 ± 0,01*# |
|
3-и сутки |
0,91 ± 0,01# |
0,80 ± 0,04*# |
|
14-е сутки |
1,90 ± 0,05*# |
0,21+0,02*# |
|
|
p3-1 < 0,05 p14-1 < 0,01 p14-3 < 0,05 |
p3-1 < 0,05 p14-1 < 0,05 p14-3 < 0,05 |
Примечания: † - содержание МЭ в плазме выражается в мг/л; * - достоверность различий между группами; * - достоверность различий с контролем (p < 0,05).
Нарушения обмена микроэлементов при повреждении сердца (табл. 3) коррелируют с активацией лизосомального аппарата.
Таблица 3
Корреляционная зависимость содержания МЭ и лизосомальных ферментов в сердечной мышце и в сыворотке крови при ЭИМ
|
|
β-галактозидаза |
кДНКза |
КФ |
Кат.D |
|
Fe A B |
-0,5 -0,6 |
-0,6 -0,7 |
-0,7 - 0,8 |
-0,7 +0,4 |
|
Zn А В |
+0,2 +0,5 |
+0,3 +0, 5 |
+0,2 - 0,6 |
+0,3 +0,5 |
Примечания: (+) положительная корреляция микроэлемента и лизосомального фермента в миокарде, (r = 0,42, p < 0,05). А - содержание МЭ в сердечной мышце; В - содержание МЭ в сыворотке крови.
Известны многочисленные клинические и экспериментальные данные о повышенном содержании железа как факторе риска развития ИБС. Установлено, что существует прямая связь между высоким уровнем сывороточного железа и риском фатального исхода инфаркта миокарда [4]. Этот отрицательный эффект ионов железа связывается с его активным влиянием на процессы ПОЛ. Так, при повышении концентрации железа в плазме резко интенсифицируются процессы ПОЛ в самых различных тканях: сердце, печени, селезёнке, самой плазме и т.д., что может приводить к повреждению лизосомальных мембран и утечке ЛзФ в плазму. Показано, что присутствие Fe2+ обязательно во всех системах образования активных радикалов кислорода из О2 (митохондриальной, микросомальной, ксантиноксидазной и др).
Обращает на себя внимание относительное постоянство уровня цинка в миокарде у животных с ЭИМ. В динамике не зарегистрировано достоверных изменений данного показателя. По-видимому, этот факт связан с исключительной значимостью данного микроэлемента в защите кардиомиоцитов от повреждения. Значимость цинка связана с тем, что он является активным центром цитозольного фермента супероксиддисмутазы, цинк принимает участие в реакции дисмутации О2- в Н2О2, выступая, таким образом, в качестве мощного антиоксиданта [5, 6]. Цинк улучшает восстановление функций миокарда после его искусственной остановки. Кроме этого, цинк, тормозя инактивацию оксида азота продуктами ПОЛ, косвенно выступает в качестве вазодилятатора. [8, 9]. Цинк индуцирует экспрессию в клетках белков-металлотионеинов и белков-иммунофиллинов (класса hsp - 70 (heat stress protein). Последние являются частью универсального механизма защиты клетки от стрессорных повреждений [7].
Рецензенты:
-
Чурляев Ю.А., д.м.н., профессор, директор филиала, который сотрудничает с ГОУ ДПО «Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей Росздрава», ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия», с Кузбасским научным центром СО РАМН (г. Кемерово), ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет», г. Томск.
-
Ломиворотов В.Н., д.м.н., профессор, зам. директора по научной работе ФГУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина» Росмедтехнологий, г. Новосибирск.