Из общего числа воспалительных заболеваний ЛОР-органов более 70% обусловлены вирусной инфекцией, в это число входят и герпесвирусные. Из них одно из первых мест занимают заболевания ЛОР-органов, возникающие в результате реактивации ВЭБ [9]. Известно, что хронический тонзиллит - это наиболее распространенное инфекционное поражение миндалин, характеризующееся нарушениями гуморального и клеточного иммунитета, которое может развиться после рецидивирующих острых тонзиллитов [8]. Поскольку хронические инфекционные процессы при ЛОР-заболеваниях могут протекать без выраженных изменений общего иммунного статуса организма, особое внимание привлекает состояние местного иммунитета [5]. Изучению показателей местной иммунной защиты ротоглоточной зоны посвящено много исследований, однако их данные не всегда однозначны. Также к числу нерешенных вопросов в оториноларингологии относится вопрос о роли вирусных инфекций и аутоиммунных реакций при хронических воспалительных заболеваниях, и их местных и общих проявлений и роли в патогенезе хронического тонзиллита.
Известно, что вирус Эпштейн-Барра (ВЭБ) имеет глобальное распространение. Источником ВЭБ является больной человек или здоровый носитель. Вирус выделяется со слюной в продромальный период, в разгаре заболевания и при выздоровлении в период до 6 месяцев. Основной путь передачи вируса - воздушно-капельный от человека к человеку. Воротами инфекции при этом служит ротоглотка. Данные литературы о появлении ВЭБ в слюне здоровых носителей противоречивы, источниками могут являться как В-лимфоциты слизистой оболочки, так и плазматические клетки или клетки плоского эпителия. Также заражение может происходить контактно-бытовым и половым путями [2]. Типичные клинические проявления многообразны, но основными симптомами являются поражение ротоглотки (хронический тонзиллит), лихорадка, генерализованная лимфоаденопатия, особенно увеличение лимфоузлов шейной группы [10]. В зависимости от длительности пребывания вируса в клетке и связанных с этим изменений в ее функционировании различают три типа течения вирусной инфекции.
Если ВЭБ после заражения начинает активно размножаться в клетке, а образующееся многочисленное вирусное потомство одновременно покидает ее, то клетка подвергается лизису и гибнет. Вышедшие вирусы поражают другие чувствительные клетки. Подобным образом развивается литическая инфекция.
При персистентной инфекции размножение ВЭБ идет медленнее, а новые вирусные частицы покидают зараженную клетку постепенно. Клетка продолжает жить и делиться длительное время, хотя ее функционирование под влиянием вируса может измениться [7].
Последний тип - латентная (скрытая) инфекция, при которой в зараженной клетке реализуется лишь часть генетической информации ВЭБ, а образование ее потомства не происходит. Однако геном вируса встраивается в ядерные структуры клетки, при ее делении воспроизводится и с клеточными хромосомами передается дочерним клеткам. Во время латентной стадии транскрибируется ограниченное количество генов вируса и синтезируется небольшая часть его белков, которые поддерживают персистенцию ВЭБ в организме. В латентной стадии вирус может сохраняться в организме человека в течение всей жизни. При иммунодефицитом состоянии, на фоне болезни латентный провирус в зараженных клетках может активироваться и размножаться (стадия репликации). Репликация ВЭБ начинается с синтеза ранних белков и ДНК с последующей продукцией вирусного капсидного антигена (VCA). Это приводит к увеличению количества генетического материала вируса, появлению зрелых вирионов. Дальнейшее развитие инфекции может происходить пи литическому либо персистентному типу [7].
В большинстве случаев первичная ВЭБ-инфекция протекает субклинически и сопровождается продукцией специфических антител. Первичная ВЭБ-инфекция может переходить в хроническую форму [1].
Для выявления ДНК ВЭБ в настоящее время широко используют ПЦР. Чувствительность ПЦР при ВЭБ-инфекции наиболее высока при использовании для анализа проб слюны [6].
Существенную значимость для серодиагностики ВЭБ-инфекции имеет также определение антител к вирусным капсидным антигенам (VCA), ранним антигенам (EA), нуклеарному (ядерному) анти- гену (NA).
Острая фаза ВЭБ-инфекции характеризуется продукцией у больного анти-VCAIgM и IgG и в большинстве случаев наличием IgM и IgG, специфичных к комплексу ранних антигенов (EA).
Анти-VCAIgM начинают продуцироваться в первые дни заболевания, и их концентрация достигает максимума на 1-2 неделе. Наличие анти-VCAIgM в высоких титрах более 3 месяцев свидетельствует о затяжном течении заболевания или иммунодефицитном состоянии больного [4].
Анти-VCAIgG можно обнаружить в крови пациентов в первые недели после заболевания, а максимальные значения их концентрации - на 2-4 неделе. Также этот маркер обнаруживается в сроки от нескольких месяцев до года после инфицирования.
Анти-NAIgG начинает выявляться в крови инфицированных через 1-6 месяцев после начала заболевания и сохраняется на достаточно высоком уровне пожизненно. Их обнаружение свидетельствует о том, что заражение пациента произошло не ранее чем за 3-4 месяца до проведения обследования. У больных с иммунодефицитными состояниями этот серологический маркер может не определяться [10].
Клиническая картина Эпштейн-Барра вирусной инфекции характеризуется четкой цикличностью с выделением традиционных периодов: продромального, развернутой клинической картины и реконвалесцен- ции [1]. Одним из ранних симптомов заболевания в остром периоде болезни является поражение ротоглотки в виде тонзиллита.
По данным одних авторов, после перенесенной первичной инфекции происходит формирование напряженного противовирусного иммунитета, на фоне которого отсутствуют клинические проявления ВЭБ инфекции, а состояние человека расценивается как носительство ВЭБ. У носителей ВЭБ небольшое количество клеток (примерно от 1 до 50 на 1 млн), в основном В-лимфоцитов несут ee вирусную эписому [11]. Другие авторы считают ВЭБ инфекцию заболеванием иммунной системы с нарушением интерферонообразования, изменениями содержания и функционального состояния Т-лимфоцитов, NК [8]. Вместе с тем практически отсутствуют данные по изменению параметров иммунной системы при латентной ВЭБ инфекции, реактивации ВЭБ и при хронической ВЭБ инфекции.
В связи с этим изучение уровня про- и противовоспалительных цитокинов позволят получить информацию о функциональной активности иммунокомпетентных клеток и особенностях инфекционного процесса при разном течении ВЭБ инфекции. Поэтому цель нашего исследования заключалась в анализе и выявлении особенностей локального цитокинового статуса (IL-6, IL-17, IL-4, IL-10, TGF-β1, sIgA) и содержание секреторного IgAу пациентов с хроническим тонзиллитом на фоне ВЭБ-инфекции.
Материалы и методы исследования
В исследование включено 50 человек (31 женщина и 19 мужчин) с диагнозом хронический тонзиллит, выставленным на основании жалоб пациентов, анамнестических данных, клинической картины. У всех пациентов произведен забор материала из зева на микрофлору и чувствительность к антибиотикам, а также методом ПЦР определяли ДНК вируса Эпштейн-Барра. Из них у 20 человек диагностирована ВЭБ-инфекция (1 группа), у 30 человек - Streptococcuspyogenes (2 группа). У всех обследованных пациентов хронический тонзиллит был в стадии обострения, о чем свидетельствовали наличие клинических симптомов, данные анамнеза и объективного осмотра. Больные обследованы в период разгара заболевания (1 день болезни), угасания клинических симптомов (7-й день) и в период реконвалесценции (28-й день). Контролем служили 15 человек - практически здоровых добровольцев, сопоставимых по полу и возрасту.
Для выявления ДНК ВЭБ использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Материалом для выделения ДНК ВЭБ служили кровь, слюна и эпителиальные клетки небных миндалин. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяли EBV-VCA-IgM, EBV-EA-IgG, EBV-NA-IgG в сыворотке крови. Определение цитокинов (IL-6, IL-17,
IL-4, IL-10, TGF-β1, sIgA) в слюне проводили с помощью специфических реактивов фирмы «R&DDiagnostic. Inc» (США) методом сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), содержание секреторного IgA определяли в слюне методом твердофазного ИФА с применением специфических реактивов ЗАО «Вектор-Бест» (Россия).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью компьютерных программ MicrosoftExel, Biostat с применением непараметрических методов и корреляционного анализа. Результаты представляли в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего квартилей (Q25; Q75). Достоверность различия определяли при p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты ПЦР-диагностики выявили у 20 человек ДНК ВЭБ в слюне и эпителиальных клетках небных миндалин. Серологические исследования, проведенные в остром периоде заболевания, позволили определить сероконверсию у всех этих пациентов. При этом EBV-VCA-IgM (+) были выявлены у 34% пациентов, EBV-EA-IgG(+) - в 76% случаев обследованных пациентов с хроническим тонзиллитом, в биоматериале которых определяли ДНК вируса Эпштейн-Барр.
Оценка локального цитокинового профиля у пациентов с хроническим тонзиллитом, ассоциированным с ВЭБ-инфекцией (рис. 1), позволила установить существенное увеличение IL-6 в первый и на 7 дни исследования, однако на 28-е сутки уровень данного цитокина снижался до показателей контрольной группы. Уровень другого провоспалительного цитокина IL-17 в слюне исходно был высоким (p < 0,05), на 7 сутки его уровень значительно повышался по сравнению с 1 днем исследования, а на 28-е сутки уровень IL-17 незначительно снижался по сравнению с 7 днем исследования, однако превышал показатели данного цитокина по сравнению с 1 днем исследования и с контрольной группой. Уровень IL-4 исходно не отличался от показателей контрольной группы, значительно повышался на 7-е сутки и снижался до уровня показателей контрольной группы в период реконвалесценции. Установлено раннее повышение противовоспалительного цитокина IL-10 в первые сутки исследования, с последующим снижением до нормальных величин с 7 по 28 сутки. Уровень другого противовоспалительного медиатора - TGF-β1 в разгаре болезни также превышал показатели контрольной группы, в период угасания клинических симптомов его значения были самыми высокими, а в период реконвалесценции локальное содержание данного цитокина незначительно снижалось, однако превышая показатели контрольной группы (p < 0,05). Установлено раннее повышение секреторного IgA(sIgA) в разгаре заболевания, значительное его повышение в период угасания клинических симптомов и снижение уровня данного иммуноглобулина в период реконвалесценции. Следовательно, у пациентов с хроническим тонзиллитом, ассоциированным с ВЭБ-инфекцией, в разгаре заболевания значительно повышен уровень IL-6, IL-10, IL-17, TGF-β1 и sIgA. При угасании клинических симптомов существенно возрастал уровень IL-4, при сохранении высоких показателей IL-17 и TGF-β1, повышении sIgA.
Установлено повышение провоспалительного цитокина IL-6 в слюне пациентов с хроническим тонзиллитом, ассоциированным со S. pyogenes (рис. 2) в первые сутки исследования, с последующим незначительным снижением с 7 по 28 сутки. Количество IL-17 было особенно высоким в разгаре заболевания с постепенным снижением с 7 по 28 сутки, однако на протяжении всего периода мониторинга его значения превышали показатели контрольной группы. Оценка уровня IL-4 у пациентов с хроническим тонзиллитом, ассоциированным со S. pyogenes, показала исходно его повышение по сравнению с контрольной группой, с дальнейшим его увеличением в 4 раза на 7 сутки и снижением к 28 суткам, однако данный показатель превышал уровень IL-4 в 1-й день исследования и показатели контрольной группы. Содержание IL-10 в слюне пациентов этой группы было в пределах нормы на всем протяжении исследования. Также отмечено увеличение уровня TGF-β1 в первые сутки исследования, со снижением на 7 и 28 сутки, но превышением данных контрольной группы. Установлено повышение sIgAв слюне больных в разгаре болезни с дальнейшим увеличением уровня данного иммуноглобулина на 7 сутки исследования и стабильно высокими показателями в период реконвалесценции. Следовательно, в период разгара заболевания, при выраженных клинических проявлениях у пациентов с хроническим тонзиллитом, ассоциированным с пиогенной микрофлорой, существенно увеличен уровень IL-6, IL-17, IL-4,TGF-β1 и sIgA. При угасании клинических симптомов сохраняется увеличениеIL-17, TGF-β1 и sIgA.
Рис. 1. Динамика локального цитокинового профиля у пациентов хроническим тонзиллитом, ассоциированным с ВЭБ-инфекцией
Рис. 2. Динамика локального цитокинового профиля у пациентов с хроническим тонзиллитом, ассоциированным со стрептококковой инфекцией
При сравнении локального цитокинового статуса двух исследуемых групп были выявлены следующие различия: уровень IL-6 иIL-10 исходно был выше при вирусной инфекции, чем при бактериальной. Уровень IL-17, IL-4 и TGF-β1 при стрептококковой инфекции в разгар заболевания превышал показатели данного цитокина при ВЭБ-инфекции,однако показатели sIgAбыли одинаковы в обоих группах. Уровень IL-6,IL-17, IL-4 и sIgA при хроническом тонзиллите вирусной природы повышен в разгаре болезни, а в период угасания клинических симптомов регистрировались высокие показатели TGF-β1 и sIgA. К 28 суткам снижались показатели IL-6, IL-4 и IL-10 до уровня контрольных значений, но сохранялось высокое содержаниеIL-17 и TGF-β1 у пациентов I группы. У пациентов II группы к 28 дню снижались показатели IL-4 до контрольных значений, также снижался уровень IL-6,IL-17, однако показатели превышали контрольные значения.
Заключение
Таким образом, результаты ПЦР-ди- агностики на выявление ДНК ВЭБ в слюне и эпителиальных клетках небных миндалин и серологические исследования (ИФА), проведенные в остром периоде заболевания, показали их высокую диагностическую ценность, что подтверждает возможности их использования в клинической практике в комплексной диагностике ВЭБ-ин- фекции. Сероконверсия EBV-VCA-IgM(+) и/или EBV-EA-IgG(+), EBV-NA-IgG(-) на фоне характерных клинических симптомов свидетельствует о реактивации ВЭБ-инфекции.
Выявлены особенности локального иммунитета при хроническом тонзиллите, ассоциированном с ВЭБ-инфекцией. ВЭБ-ин- фекция характеризуется увеличением IL-6, IL-10 и sIgA в период разгара болезни. IL-6 синтезируется многими типами клеток, участвующими в инициации и регуляции воспаления и иммунного ответа: Т-лимфоцитами, моноцитами/макрофагами и некоторыми другими клетками. IL-6 в организме активирует пролиферацию активированных антигеном В-лимфоцитов, активирует пролиферацию Т-лимфоцитов, усиливает функциональную активность Т-киллеров, стимулирует гранулоцитарный росток кроветворения и проявления активности мульти-CSF в сочетании с IL-13. Провоспалительное действие IL-6 реализуется за счет активации экспрессии молекул адгезии на эндотелии и хемотаксиса некоторых типов лейкоцитов, усиления функциональной активности фибробластов и остеокластов, активации острофазового ответа путем индукции синтеза в печени С-реактивного белка, сывороточного амилоида А и фибриногена. Так IL-6, кроме главной функции активатора защитных реакций, выполняет также роль регулятора развития иммунитета. Интерлейкин-10 вырабатывается Th2-клетками, а также моноцитами и цитотоксическими и регуляторными Т-клетками. Основной эффект интерлейкина-10 заключается в подавлении синтеза цитокинов Th1-клетками и в снижении активности макрофагов, в том числе продукции провоспалительных цитокинов. Интерлейкин-10 подавляет экспрессию молекул МНС II класса, пролиферацию Т-клеток, вызванную митогенами, а также развитие гиперчувствительности замедленного типа. Одновременно может стимулировать синтез IgE. В результате интерлейкин-10 способствует развитию гуморальной составляющей иммунного ответа. Показано, что ДНК и аминокислотные последовательности человеческого IL-10 высокогомологичны с 1 фактором, антиген-распознающего рецептора В-клеток (BCRF1), который кодируется геномом вируса Эпштейна-Барр и имитирует многие клеточные биологические функции этого цитокина, следовательно, может играть роль во взаимодействии «хозяин-вирус» [3]. Также нами выявлено увеличение IL-4 на 7 сутки исследования, и стабильно повышенный с 7 дня уровень TGF-β1 в слюне у пациентов с ВЭБ-инфекцией. Высокий уровень IL-10 в разгаре болезни может служить дополнительным признаком ВЭБ-инфекции на фоне хронического тонзиллита.
Высокий локальный уровень IL-17 в обеих группах на всех этапах мониторинга свидетельствует о том, что воспаление сохраняется. Основными продуцентами ИЛ-17 являются CD4+ и CD8+ Т-клетки, а также IL-23, который активирует продукцию данного цитокина в ответ на инфекцию. Преимущественно провоспалительные и гемопоэтические активности ИЛ-17 являются следствием их способности стимулировать продукцию цитокинов и хемокинов. ИЛ-17 является наиболее активным в индуцировании продукции бета-2-дефензина человека, колониестимулирующего фактора для гранулоцитов и воспалительного белка макрофагов человека, которые являются основными компонентами врожденного иммунитета. Th-17 вовлекаются в иммунный ответ и патогенетически связаны с развитием хронического тонзиллита.
Рецензенты:
-
Запорожец Т.С., д.м.н., зам.директора по научной работе ФГБУ «НИИЭМ» СО РАМН, г. Владивосток;
-
Иванис В.А., д.м.н., профессор кафедры инфекционных болезней ГБОУ ВПО «ВГМУ» Минздравсоцразвития России, г. Владивосток.
Работа поступила в редакцию 26.03.2012.