При исследовании перитуморозной зоны (ПЗ) почечно-клеточного рака (ПКР) перед морфологом встает ряд нерешенных проблем и прежде всего - это проблема ренальной интратубулярной неоплазии (РИН).
Проблема предраковых изменений относительно ПКР остается малоизученной [2, 9]. Одним из первых сообщений о наличии морфологических изменений в тубулярном эпителии в виде гиперплазии извитых канальцев и их отношение к ПКР принадлежит Prinke A. (1936). Данные изменения автор рассматривал как компенсаторные по периферии рубца. Использование термина «дисплазия эпителия канальцев» принадлежит Warter R. (1983). В 1994 г. Мourad W. и соавт. впервые описали зоны интратубулярной эпителиальной дисплазии при в ПЗ при ПКР, преимущественно в корковом слое, которые выявлялись более чем в 25 % случаев. В последующей работе данные авторы выявили такие зоны уже в 54 % случаев. Yorycoglu K. и соавт. (1999) описали подобные изменения у 14 из 62 больных ПКР (23 %), причем в треx случаях - в виде карциномы in situ (5 %). Зоны пролиферации и дисплазии эпителия сосочковых протоков, связанные с развитием рака собирательных протоков, впервые были описали Fleming S. и Lewi H. (1986), а также Kinnedy S. [7].
В 2000 г. группой европейских патологов для обозначения указанных изменений был предложен термин - RIN-ренальная интратубулярная неоплазия. Последняя представлена в виде зон обычно расположенных невдалеке от опухолевого узла и нередко в ассоциации с явлениями нефросклероза. Эпителиальные клетки в таких зонах варьируются в размере, и их ядра увеличены [3].
В литературе имеется небольшое количество работ, посвященных иммуногистохимическому исследованию РИН. Так, показано, что позитивная корреляционная связь между показателями экспрессии PCNA, K-ras и c-erb-B-2 в опухолевой ткани и очагах РИН является веским аргументом в пользу предракового характера РИН [4, 8].
Целью исследования стало иммуногистохимическое выявление уровня экспрессии маркеров Ki-67, Bcl-2 и р53 в эпителии канальцев ПЗ рака почки.
Материал и методы исследования
Изучен операционный материал 42 больных ПКР. Средний возраст пациентов составил 57,4 ± 1,4 года. Мужчин было 25 (59,5 %), женщин - 17 (40,5 %). По гистологическому строению опухоли были представлены следующим образом: светлоклеточный рак - 28; зернистоклеточный рак - 8; папиллярный рак - 5 и саркоматоидный рак - 1.
При группировке опухолей по клиническим стадиям (Ι-ΙV) было выделено: Ι стадии (T1N0M0) соответствовали 22 (52,4 %) наблюдения; ΙΙ стадии (T2N0M0) 1 (2,4 %) наблюдение; ΙΙΙ стадии (T1N1M0, T2N1M0, T3N0M0, T3N1M0) - 8 (19 %) и ΙV стадии (T4N0M0, T4N1M0, TлюбаяN2M1, TлюбаяNлюбаяM1) - 11 (26,2 %). Степень злокачественности клеток опухоли оценивали по Fuhrman S.A. и соавт (1982) [6]. В изученном материале было 2 (4,8 %) опухоли степени анаплазии G1; 11 (26,2 %) опухолей степени анаплазии G2; 22 (52,4 %) степени анаплазии G3 и 7 (16,7 %.) степени G4.
В процессе исследования больные были разделены на 2 группы. В 1-ю группу вошли пациенты с диплоидными, триплоидными (в среднем 3,4 с) опухолями небольшого размера (≤ 7 см), степени злокачественности G 1-2, низкими значениями AgNORs (≤ 5 AgNOs) и отсутствием метастазов. Во 2-ю группу были включены больные с полиплоидными и анеуплоидными (в среднем 5,6 с) опухолями большого размера ( > 7 см), степенями злокачественности G 3-4, высокими значениями AgNORs ( > 5 AgNORs) и наличием метастазов.
Материал забирали из центра опухоли, ПЗ (за ПЗ принимали непосредственно прилижащую в псевдокапсуле опухолевую ткань, псевдокапсулу и ткань, расположенную за псевдокапсулой до неизмененной ткани почки) и неизмененной ткани почки, из максимально отдаленных от опухоли участков. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином, на коллаген по ван Гизон и на эластические волокна резорцин-фуксином по Вейгерту.
Активность аргирофильных белков, ассоциированных с областью ядрышкового организатора (AgNOR), выявляли с помощью реакции по Daskal Y. et al [5], в нашей модификации [1].
Морфометрические и микроспектрофотометрические исследования проводили с использованием системы компьютерного анализа изображений, состоящей из микроскопа Leica DМЕ, цифровой камеры Leica EC3 (Leica Microsystems AG, Германия), персонального компьютера и программного обеспечения ВидеоТест - Морфология 5.2. Плоидометрию ДНК проводили на гистологических срезах, окрашенных по Фельгену. Среднее содержание ДНК в ядрах малых лимфоцитов принимали за диплоидное (2с) и использовали в качестве стандарта. Для получения стандарта в каждом срезе оценивали 25-30 лимфоцитов. Затем в исследуемых эпителиальных клетках высчитывали содержание генетического материала в единицах плоидности (с).
Уровень экспрессии молекулярно-биологических маркеров р53 (клон DO-7, «DAKO»), Bcl-2 (клон 124, «DAKO») и Ki-67 (клон MIB-1,«DAKO») определяли при помощи иммуногистохимического метода по рекомендованным производителем протоколам.
Пролиферативную активность (ПА) эпителия определяли путем выявления в ядрах клеток антигена Ki-67. Подсчет проводили на 1000 клеток на цифровых микрофографиях с помощью морфометрической программы Image Tool 3.0, с последующим выражением результата в процентах. Индекс мечения (ИМ) маркера менее 5,0 % считали проявлением низкой, а 5,0 % и - более высокой ПА.
При оценке ИГХ окрашивания bcl-2 использовали полуколичественный метод: 0 баллов - отсутствие окрашивания; + (1 балл) - более 20 % клеток со слабой интенсивностью окрашивания цитоплазмы; ++ (2 балла) - умеренное окрашивание цитоплазмы; +++ (3 балла) - интенсивное окрашивание цитоплазмы; ++++ (4 балла) - интенсивное окрашивание цитоплазмы более чем 80 % клеток. В тех случаях, когда интенсивность окрашивания варьировалась, например от + (1 балл) до ++ (2 балла), получали среднее - 1,5 балла. Когда выявляли равномерное окрашивание цитоплазмы всех клеток, тогда цифра, характеризующая интенсивность окрашивания, была круглой: + (1), ++ (2), +++ (3) или ++++ (4 балла).
Интенсивность ИГХ - окрашивания р53 оценивалась как негативная (нет окрашивания), слабо позитивная (< 5 % окрашенных клеток), умеренно позитивная (> 5 % средней интенсивности окраски) и сильно позитивная (> 5 % высокой интенсивности окраски).
Статистическую обработку материала проводили при помощи статистического пакета Statistica 6.0. При нормальном распределении данных при проверке статистических гипотез применяли методы параметрической статистики (t-test Стьюдента), а если полученные данные не соответствовали критериям нормального распределения (критерий Шапиро - Уилка W = 0,89, p < 0,01), то применяли тест Колмогорова - Смирнова или U-тест Манна - Уитни. Данные считали достоверными при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты проведенного исследования показали, что гистологическое строение, активность пролиферативных процессов и апоптоза в ПЗ зависело, прежде всего, от молекулярно-биологических и анатомических особенностей опухолей в группах исследования (таблица).
В ПЗ Ι группы больных элементы канальцевого эпителия встречались в небольшом количестве. Они мало отличались от канальцев неизменного эпителия почки. Площадь ядра клеток в среднем составила 37,9 ± 2,0 мкм2. Число AgNORs составило 2,25 ± 0,22 на 1 ядро. При микроспектрофотометрическом исследовании в клетках эпителия канальцев содержание ДНК составило 3,9 ± 0,2, что может говорить о гиперпластических и пролиферативных процессах, происходящих в эпителии.
Биологические и клинико-анатомические параметры опухолей в группах исследования (М ± m)
|
Параметры опухолей |
Группы пациентов |
|
|
І группа |
ІІ группа |
|
|
Плоидность ядра (с) |
3,4 ± 0,1* |
5,6 ± 0,2* |
|
Количество AgNORs на 1 ядро |
5,3 ± 0,2* |
14,4 ± 0,5* |
|
Размер опухолевого узла (см) |
7 ≤ |
> 7 |
|
Степень анаплазии по Фурману (G) |
І, ІІ |
ІІІ, ІV |
|
Наличие метастазов |
N- |
N+ |
Примечание: * - P < 0,05.
В ПЗ ΙI группы больных, в большем количестве отмечались элементы канальцевого аппарата почки. Канальцы были замурованы в плотной склерозированной и гиалинизированной соединительной ткани с выраженным эластозом и содержали небольшое число клеточных элементов. Клетки нефротелия имели признаки атипизма: полиморфизм, гиперхромию ядра и увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения. Средняя площадь ядра составила 54,2 ± 5,3 мкм2. Число AgNORs в ядрах клеток достигало 5,15 ± 0,35 на 1 ядро. Во второй группе пациентов было обнаружено увеличение среднего содержания ДНК до 5,5 ± 0,2, что свидетельствует о тяжелой дисплазии.
Нами было проведено сравнение степени экспрессии Ki-67; р53; bcl-2 в обеих группах.
В неизмененной ткани почки, взятой из максимально удаленных от опухоли участков в канальцевом эпителии, ИМ маркера пролиферации Ki-67 колебался от 0 до 8 % (в среднем 1,6 ± 0,6 %). При этом в неизмененном эпителии I группы больных ИМ Ki-67 составил 1,0 ± 0,4 %, а во II группе возрастал до 2,9 ± 1,1 %. ИМ Ki-67 в эпителии канальцев в ПЗ I группы варьировался в пределах от 0 до 3 % и в среднем составил 1,8 ± 0,5, а во II группе возрастал до 3,5 ± 0,9, пределы колебаний составили от 0 до 8 % (рис. 1. а, б).
Рис. 1. ИМ Ki-67 в эпителии канальцев ПЗ в группах исследования: а - низкий ИМ Ki-67 в эпителии канальцев ПЗ в І группе исследования; б - высокий ИМ Ki-67 в эпителии канальцев ПЗ во ІІ группе исследования. ИГХ окрашивание. Увеличение х 1000
При исследовании экспрессии белка-супрессора апоптоза bcl-2 в неизмененной ткани почки иммуноокрашивание маркера обнаруживали во всех случаях, ее интенсивность в среднем составила 1,8 ± 0,1 баллов. Результаты иммуноокрашивания bcl-2 в цитоплазме клеток эпителия канальцев ПЗ в I группе больных были отрицательными (0 баллов) или интенсивность окраски была слабой (1 балл), а в ПЗ II группы экспрессия маркера в эпителии во всех случаях была интенсивной (3 и 4 балла) (рис. 2. а, б).
При исследовании экспрессии гена-активатора апоптоза р53 в неизмененной ткани почки иммуноокрашивание маркера обнаруживали p53 во всех случаях, слабо позитивное окрашивание отмечали в 86,96 % случаев и умеренно позитивное в 13,04 % случаев. Иммуноокрашивание ядер клеток эпителия канальцев ПЗ на р53 в I группе пациентов в 9,1 % случаев было негативным, в 72,7 % слабо позитивным, в 9,1 % умеренно позитивным и в 9,1 % сильно позитивным. Во ІІ группе исследования негативной реакции отмечено не было, слабо позитивное окрашивание отмечалась в 27,2 % случаев, умеренно позитивное в 36,4 % и сильно позитивное в 36,4 % (рис. 3. а, б).
Рис. 2. Иммуноокрашивание bcl - 2 в эпителии канальцев ПЗ в группах исследования: а - отрицательное и слабое иммуноокрашивание на bcl - 2 эпителия канальцев ПЗ в І группе исследования; б - умеренное и интенсивное иммуноокрашивание на bcl - 2 эпителия канальцев ПЗ во ІІ группе исследования. ИГХ окрашивание. Увеличение х 400
Рис. 3. Иммуноокрашивание на р53 в эпителии канальцев ПЗ в группах исследования: а - слабая интенсивность иммуноокрашивания р53 эпителия канальцев ПЗ в І группе исследования; б - сильная интенсивность иммуноокрашивания р53 эпителия канальцев ПЗ во ІІ группе исследования. ИГХ окрашивание. Увеличение х 1000
Заключение
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что процессы пролиферации и апоптоза в ПЗ рака почки зависели, прежде всего, от биологических и клинико-анатомических особенностей опухоли. В ПЗ зонах опухолей высокой степенью злокачественности, по сравнению с опухолями низкой степени злокачественности, в эпителии канальцев отмечались возрастание процессов пролиферации (по данным выявления антигена Ki-67). Также в эпителии канальцев ПЗ таких опухолей было обнаружено увеличение числа AgNORs, что говорит о возрастании скорости пролиферации. В ПЗ опухолей высокой степени злокачественности в эпителии канальцев в большей мере отмечали экспрессию активатора апоптоза р53, что, скорее всего, говорит о мутации гена р53 и его активации в условиях гипоксии на фоне склеротических процессов, происходящих в ПЗ. Исследование белка супрессора-апоптоза bcl-2 в ПЗ опухолей высоких степеней анаплазии показало высокую степень его экспрессии. Данный факт может свидетельствовать о блокаде апоптоза в патологически измененных клетках, что способствует их выживанию и размножению. Таким образом, найденные изменения, происходящие в эпителии канальцев ПЗ рака почки, можно отнести к проявлениям ренальной интратубулярной неоплазии, степень которой зависит от особенностей неоплазии.
References
Рецензенты:
-
Калачев Г.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой анатомии, физиологии и валеологии ГОУ ВПО «Алтайская государственная педагогическая академия», г. Барнаул.
-
Высоцкий Ю.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой нормальной анатомии человека ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» г. Барнаул.
Работа поступила в редакцию 06.02.2012.