Проблема эффективной комплексной терапии инфекционных заболеваний относится к числу наиболее актуальных в современной медицине. Ведущая роль в этой терапии отводится антибактериальным препаратам, адекватное применение которых определяет эффективность лечения [5]. Несмотря на мощный арсенал антибактериальных средств, количество гнойно-септических осложнений в различных областях хирургии остается высоким [6]. Одной из причин данных осложнений является формирование антибиотико-резистентных штаммов бактерий. В настоящее время Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), вызывающая нозокомиальные инфекции и, в частности, сепсис, при котором смертность стабильно высока [8], рассматривается как один из наиболее значимых микроорганизмов, характеризующихся высокой резистентностью к антибактериальным препаратам [5, 11].
В настоящее время твердофазная механохимическая технология получения композиций лекарственных препаратов с веществами-«носителями» продемонстрировала свою эффективность для повышения фармакологической активности и безопасности ряда лекарственных препаратов [1, 2, 7]. Так как антибиотикотерапия является одним из базовых компонентов интенсивной терапии сепсиса, создание новых соединений антибиотиков с широким антимикробным спектром, низкой токсичностью и высокой антибактериальной активностью на основе методов механохимии является актуальным.
Целью данного исследования было сравнительное изучение антимикробной активности различных форм цефтазиди- ма - официнальной и модифицированных механохимической обработкой, сопровождаемой сорбцией на наноструктурированных частицах диоксида кремния в различных соотношениях.
Материал и методы исследования
Цефтазидим, антибиотик группы цефалоспоринов III поколения, является препаратом выбора для лечения нозокомиального сепсиса, ассоциированного с P. aeruginosa [12].
Модификация цефтазидима осуществлялась путем механической обработки смеси антибиотика и коллоидного диоксида кремния (SiO2) (энтеросорбент «Полисорб», Россия) в шаровой мельнице (энергонапряженность 1g) в массовых соотношениях антибиотик/SiO2 - 100:1; 75:1; 60:1; 50:1 и 30:1 [2], с целью формирования механокомпозитов и изменения физико-химических свойств антибиотика. Электронные микрофотографии наноструктурированного SiO2 (нано - SiO2) получали на электронных микроскопах JEOL HITACHI (Япония). Гранулометрический состав водных суспензий исходного диоксида кремния и его композиций с цефтазидимом определяли на лазерном гранулометре Micro-Sizer 201 (Россия). Концентрации водных растворов цефтазидима определялись методом ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1200 (США).
Для оценки степени сорбции навеску композиции антибиотик/диоксид кремния, рассчитанную для получения раствора с концентрацией цефтазидима 100 г/л, суспендировали в 5 см3 дистиллированной воды и центрифугировали в течение 30 мин при скорости 12000 об/мин. Затем надосадочную жидкость сливали, осадок повторно суспендировали в таком же количестве дистиллированной воды. Концентрация антибиотика, десорбировавшегося в водную фазу, определялась методом ВЭЖХ. Количество сорбированного антибиотика рассчитывалось из суммарного определения количества антибиотика, десорбировавшегося из нано-SiO2. Было экспериментально определено, что более 95 % сорбированного антибиотика удается «извлечь» уже за 2 цикла осаждения/суспендирования.
Биологические эксперименты проводили на мышах - самцах (CBA×C57Bl/6)F1, в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08. 1977 г. № 755). Для оценки терапевтической эффективности цефтазидима использовали модель экспериментального сепсиса у лабораторных животных, индуцированного P. аeruginosa.
Для индукции сепсиса мышам внутривенно вводили 24-часовую культуру P. aeruginosa ATCC № 27853 в объеме 0,5 мл (5·108 КОЕ/мышь). Через 24 часа от момента индукции септического процесса, в течение 3 дней, ежедневно, внутривенно, однократно вводили контрольной группе живот- ных - 0,9 %-й раствор хлорида натрия, а опытным группам - по 2,5 мг/мышь (0,25 мл) раствора нативного цефтазидима или механокомпозита из различных соотношений антибиотика и нано-SiO2. Все исследуемые группы состояли из 10 животных. Проведено 3 независимых эксперимента. Выживаемость мышей учитывали ежедневно, начиная со 2-х суток от момента индукции сепсиса, до 8 суток включительно. Влияние официнальной и модифицированной формы цефтазидима (цефтазидим/нано-SiO2 - 30:1) на фагоцитоз эритроцитов барана перитонеальными макрофагами, продукцию активных форм кислорода, уровень внеклеточного и внутриклеточного оксида азота (NO) in vitro исследовали в соответствии с методами [3, 4]. Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ Statistica 6,0. Результаты представляли в виде медианы (Me), нижнего и верхнего квартиля (Lq-Hq), достоверность различий рассчитывалась по Х2-критерию и U-критерию Манна-Уитни и принималась при значениях p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Структурные характеристики композиций. Использованный нами материал коллоидного аморфного диоксида кремния состоял из округлых наночастиц размером 20-100 нм, агрегированных в рыхлые агрегаты размером 5-100 мкм, что продемонстрировано на приведенных электронных микрофотографиях (рис. 1).
В водной среде агрегаты частично разрушались. При механохимическом получении композиций с цефтазидимом происходило дальнейшее уменьшение размеров агрегатов. Гистограммы и численные данные распределения по размерам частиц приведены на рис. 2 и в табл. 1.
Рис. 1. Электронные микрофотографии коллоидного аморфного диоксида кремния при различном увеличении: а - наноразмерный диапазон; б - микроразмерный диапазон
Рис. 2. Гистограммы распределения по размерам частиц (мкм) в водных суспензиях исходного коллоидного аморфного диоксида кремния (а) и его композиции с цефтазидимом в массовом соотношении цефтазидим/нано-SiO2 = 30/1
Таблица 1 Данные гранулометрического состава полученных микрокомпозиционных материалов в весовых (объемных) процентах от расчетного
|
Состав, условия получения |
%, < 3, мкм |
%, < 5, мкм |
%, < 10, мкм |
|
Коллоидный диоксид кремния исходный |
0,5 |
5,3 |
25,7 |
|
Цефтазидим/коллоидный нано-SiO2, 30/1 по весу, механическая активация в течение 2 часов |
14,3 |
23,3 |
33,0 |
|
Цефтазидим/коллоидный нано-SiO2, 30/1 по весу, механическая активация в течение 4 часов |
23,8 |
38,9 |
56,2 |
Из полученных данных следует, что в композициях, полученных механохимически, удается существенно увеличить массовую долю мелких (менее 3-5 мкм), потенциально наиболее биологически активных фракций частиц - носителей.
Иммобилизация антибиотика частицами диоксида кремния. Мы провели оценку количества цефтазидима, сорбированного на нано-SiO2. Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2 Экспериментально определенная степень сорбции цефтазидима на коллоидном диоксиде кремния в полученных композициях при массовом соотношении цефтазидим/нано-SiO2 = 30/1
|
Длительность механической обработки, часов |
Количество сорбированного антибиотика, мг /количество нано-SiO2, мг (вес. %) |
|
Смесь без обработки |
10,5 мг/16,7 мг(63 %) |
|
0,5 |
6,7 мг/16,7 мг(40 %) |
|
1 |
6,4 мг/16,7 мг(38 %) |
|
2 |
6,4 мг/16,7 мг(38 %) |
|
4 |
7,2 мг/16,7 мг(43 %) |
Из механохимически полученных композиций антибиотик/нано-SiO2 образуются достаточно плотные осадки, тогда как при центрифугировании композиций, полученных простым смешиванием компонентов (без механохимической обработки), осадок SiO2 становится гелеобразным и содержит большое количество водной фазы исходной суспензии - фактически, раствора антибиотика. Таким образом, оценка количества сорбированного антибиотика в «физических смесях» антибиотик - Полисорб имеет завышенное значение. В пределах точности экспериментов (±10 %) количество сорбированного цефтазидима не меняется, и это позволяет выбирать минимально возможное время механической обработки в пределах 0,5-2 часов. При увеличении массовых соотношений антибиотика в композициях, полученных механохимически, цефтазидим/нано - SiO2 от 10/1 до 40/1, степень сорбции незначительно увеличивается - от ~35 % до ~40 %, что позволяет считать их приблизительно одинаковыми. Такая относительно неизменная степень сорбции и легкость высвобождения сорбированного антибиотика, по нашему мнению, указывает на объемный механизм сорбции за счет эффекта мезопористости использованного материала SiO2, то есть концентрационном накоплении антибиотика в порах частиц коллоидного диоксида кремния. Эта гипотеза позволяет предположить, что при увеличении массовых соотношений цефтази- дим/SiO2 степень сорбции останется приблизительно постоянной.
Однако независимо от возможного механизма сорбции, механохимическая обработка позволяет многократно увеличить массовую (до ~50 раз) и соответственно количественную долю малоразмерных (менее 3-5 мкм) фракций частиц нано-SiO2, и, тем самым, увеличить количество цефтазидима, сорбированного наиболее биологически активными микро- и наноразмерными частицами.
Исследование терапевтической эффективности модифицированного цефтазидима. В серии предварительных экспериментов была определена доза P. aeruginosa, составлявшая 5·108 КОЕ/мышь, которая приводила к 100 % гибели мышей в течение периода наблюдения.
В результате проведенных экспериментов было установлено, что на 8 сутки от момента индукции сепсиса в контрольной группе, получавшей физиологический раствор, все мыши погибли от сепсиса. В группе мышей, получавших нативный цефтазидим, выживаемость животных составила 50 %. В то же время среди групп мышей, которым вводили модифицированные формы цефтазидима в виде механокомпозита, выживаемость при сепсисе была различной при разных соотношениях антибиотика и нано-SiO2. При соотношении цефтази- дим/нано-SiO2, равном 50:1 отмечена 100 %-я выживаемость мышей. По мере увеличения доли антибиотика и уменьшения доли нано-SiO2 в механокомпозите с 50:1 до 100:1 выявлено снижение выживаемости мышей к 8-м суткам эксперимента (рис. 3).
В то же время нано-SiO2 не обладает собственными антибактериальными свойствами, о чем свидетельствуют данные литературы [10], а также снижение выживаемости животных при дальнейшем увеличении доли нано-SiO2 до 30:1. При соотношениях антибиотик/нано-SiO2 60:1, 50:1 и 30:1 получены статистически значимые различия выживаемости между группами мышей, получавших лечение официнальной формой цефтазидима и модифицированными его формами.
Таким образом, сорбция цефтазидима на наноструктурированном SiO2 способствуют увеличению терапевтической эффективности данного антибиотика при экспериментальном сепсисе, индуцированном P. aeruginosa.
Так как исход любого гнойно-септического процесса зависит не только от антибактериальной активности антимикробного препарата, вирулентности и чувствительности к нему возбудителя заболевания, но и от способности макроорганизма противостоять инфекции, создание антибактериальных препаратов, обладающих способностью стимулировать противоинфекционную резистентность, является перспективным направлением фармакологии [6]. Способность нано-SiO2 проникать внутрь клетки [9] позволяет предположить возможность фагоцитоза данных частиц клетками системы мононуклеарных фагоцитов, с последующей их активацией и продукцией неспецифических факторов защиты. Поэтому для оценки функционального состояния клеток моноцитарно/макрофагальной системы мы изучали воздействие модифицированного цефтазидима (цефтазидим/нано-SiO2 - 30:1) на уровень фагоцитоза и продукцию активных форм кислорода перитонеальными макрофагами мышей. Результаты трех независимых экспериментов представлены на рис. 4 и 5.
Рис. 3. Выживаемость мышей (CBA×C57Bl/6)F1 с экспериментальным сепсисом, индуцированным P. aeruginosa, на фоне лечения различными формами цефтазидима Примечание: Оф - официнальная форма цефтазидима; Мф - модифицированная форма цефтазидима; * - достоверность различий с контрольной группой; ** - достоверность различий между официнальным и модифицированным препаратом
Рис. 4. Влияние различных форм цефтазидима на уровень фагоцитоза и продукцию активных форм кислорода перитонеальными макрофагами мышей in vitro Примечание: Оф - официнальная форма цефтазидима; Мф - модифицированная форма цефтазидима; * - достоверность различий между официнальным и модифицированным препаратом
Рис. 5. Влияние различных форм цефтазидима на уровень внутриклеточной и внеклеточной продукции оксида азота перитонеальными макрофагами мышей in vitro Примечание: Оф - официнальная форма цефтазидима; Мф - модифицированная форма цефтазидима; * - достоверность различий между официнальным и модифицированным препаратом
В результате проведенных экспериментов было выявлено увеличение внутриклеточной продукции NO и активных форм кислорода, а также более высокий уровень продукции NO во внеклеточное пространство и активация фагоцитоза перитонеальными макрофагами мышей под действием модифицированного цефтазидима (p < 0,05). Следовательно, применение механохимически модифицированного цефтазидима, сорбированного на наноструктурированном SiO2, приводит к повышению функциональной активности моноцитов/макрофагов.
Заключение
В результате использования механохимической технологии получения композиций антибиотик/нано-SiO2 происходит многократное увеличение доли наиболее биологически активных частиц нано-SiO2 в механокомпозите, которые одновременно являются «носителями» активного антимикробного агента - цефтазидима. При исследовании антимикробной активности механохимически модифицированного цефтазидима, сорбированного на наночастицах диоксида кремния, на основании его терапевтической эффективности на модели экспериментального сепсиса, индуцированного P. aeruginosa у мышей, было установлено, что более высокая активность характерна для модифицированных форм антибиотика при соотношениях антибиотик/нано-SiO2 30:1 - 60:1. Одним из предполагаемых механизмов повышения антимикробной активности является поглощение моноцитами/макрофагами частиц нано-SiO2 с сорбированным в них цефтазидимом и увеличение функциональной активности этих клеток, что, наряду с прямым антимикробным действием антибиотика, способствует санации макроорганизма от инфекции.
Рецензенты:
-
Павлов В.В., д.м.н., ведущий научный сотрудник, зав. отделением эндопротезирования и эндоскопической хирургии суставов ФГУ «Новосибирский НИИТО» Росздравсоцразвития, г. Новосибирск.
-
Смагин А.А., д.м.н., профессор, заведующий лабораторией лимфодетоксикации НИИКЭЛ СО РАМН, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 26.01.2012.