В настоящее время накоплен значительный экспериментальный и клинический материал, свидетельствующий о важной роли свободно-радикального окисления (СРО) в изменении структуры биомолекул [4, 3, 1]. Инициатором СРО выступают активные формы кислорода, образование которых усиливается при многих воспалительных и воспалительно-деструктивных заболеваниях, в том числе и при красном плоском лишае, сопровождающемся эрозивно-язвенными изменениями в полости рта [2, 6]. Образованные в очаге воспаления АФК взаимодействуют со всеми классами органических соединений: белками, полисахаридами, коллагеном, но наиболее чувствительны к ним полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК). Поэтому перекисное окисление липидов рассматривается как один из уникальных фундаментальных механизмов повреждения клеточных мембран. Вместе с тем «дыхательный взрыв» в моноцитах и макрофагах сопровождается быстрым повышением внутриклеточного содержания глутатиона. Активация фактора транскрипции NF - кB повышает устойчивость клеток к апоптозу индуцированным воздействием активных метаболитов кислорода.
Таким образом, одновременно с усилением продукции АМК моноциты и макрофаги повышают свой уровень антиоксидантной защиты (АОЗ). Антиоксидантная система (АОС) включает ферментные и неферментные формы защиты от ПОЛ, способные инактивировать активные формы кислорода, осуществлять обрыв цепей на стадии зарождения липидных радикалов и гидроперекисей. В ферментативной защите принимают участие супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионредуктаза, гидроперекисидаза - обезвреживающие первичные и промежуточные продукты ПОЛ. Основанием для научного интереса к использованию электрохимически активированных систем (ЭХАС) в виде водных растворов, является возможность регулирования показателей окислительно-восстановительного потенциала и рН внутренних сред, вследствие образования ОН- и Н+ групп. В соответствии с существующим патентом [5] эта вода эффективна в клинической практике для лечения воспалительных процессов полости рта, патологических процессов кожи, слизистых, а также гнойных ран. Более того, использование такой активированной воды является путем фармакологической стимуляции антиоксидантной защиты организма.
Разработанная новая технология воздействия на АОС ЭХАС в виде водных растворов позволяет вводить в организм стандартизированную по показателям ОВП и рН воду, обогащенную за счет электрохимической обработки по ОН- или Н+ группам и с регулируемым ОВП.
Цель исследования: изучение влияния ЭХАС на активность ферментов АОЗ: СОД, каталазы и глутатионпероксидаза in vitro и in vivo на интактных кроликах.
Материал и методы исследования
Исследования проведены на 11 интактных кроликах, получавших в течение 48 часов питье с 200 мл ЭХАС с ОВП с 60 мВ. ЭХАС получали, пропуская раствор хлористого натрия (1 г/л) через установку «Изумруд», имеющую 2 реакционных блока и обеспечивающую получение ЭХАС с ОВП от +200 до - 70 мВ. Определение и постоянный контроль за ОВП проводился в течение опыта на рН-метре с платиновыми электродами в стандартном режиме определения ОВП проб. По окончании эксперимента забиралась кровь их ушной вены с антикоагулянтом трилоном, после центрифугирования производили трехкратное отмывание эритроцитов физиологическим раствором с последующим их гемолизом. В гемолизате эритроцитов определяли активность ферментов АОС: СОД, каталазы и пероксидазы. Активность каталазы определяли по скорости расщепления перекиси водорода с регистрацией оставшегося количества перекиси в реакции с молибдатом аммония. Об активности пероксидазы судили в реакции с перекисью водорода в присутствии окислительно-восстановительного индикатора - индигокармина; активность СОД - по реакции ингибирования восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) супероксидными ионами, генерируемыми в реакции с НАДФНН+ с фенилметилсульфонатом (ФМС). В другом варианте исследования проводили определение указанных ферментов АОС в гемолизате эритроцитов, инкубированных in vitro с разными концентрациями ЭХАС и ОВП.
Весь полученный материал обрабатывали методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента на ПК по программе Microsoft Excel.
Результаты исследования и их обсуждения
Анализ данных, полученных in vivo на кроликах, которых поили в течение 48 часов электрохимически активированной водой, показал, что происходит активация ферментов АОС, в частности, супероксиддисмутазы (СОД). Чувствительность СОД эритроцитов к действию ЭХАС статистически достоверно возрастает. Эти данные подтверждают, что более активная СОД, обеспечивающая реакцию дисмутации супероксид анион радикала, способствует стимулированию образования перекиси водорода как менее реактивного соединения. Исследования, проведенные в экспериментах in vitro, позволили выявить прямое влияние ЭХАС на активность СОД и показали позитивные изменения. Активность СОД возросла статистически достоверно, что подтверждает возможность конформационных изменений молекулы фермента под влиянием образовавшихся в среде метастабильных структурных аномалий воды (электростатического поля) (рис. 1).
Рис. 1. Влияние ЭХАС на активность СОД эритроцитов кроликов in vivo и на чувствительность фермента при инкубации с лизатом эритроцитов in vitro
Изучение влияния ЭХАС на эффективность СОД в зависимости от времени преинкубации с лизатом эритроцитов показало, что при преинкубации в течение 5 минут отмечается стимулирование чувствительности СОД, а при 10-минутной инкубации влияние ЭХАС приобретает двуфазный характер, когда начальная активация сменяется снижением чувствительности фермента; при 20-минутной инкубации выявляется только явление ингибирования. Следовательно, для влияния ЭХАС на активность СОД характерна дозовременная зависимость. Исследование активности каталазы в опытной группе кроликов с поением ЭХАС сравнительно с контрольной группой, показало, что потребление субстрата за время реакции с каталазой эритроцитов возрастало, что свидетельствовало об активировании данного энзима (рис. 2).
Рассмотрение влияния ЭХАС по каждому из животных отдельно показывает в условиях in vivo также активацию фермента. Сохраняется при средних значениях концентрации также стимулирующее влияние ЭХАС на каталазу лизата эритроцитов в опытах in vitro. Причем следует отметить, что при преинкубации пробы эритроцитов с различными концентрациями ЭХАС в течение 5-20 минут выявляется быстрое активирование фермента с последующим возвращением к исходному уровню активности. Таким образом, влияние ЭХАС на каталазу кроликов характеризуется время- и дозозависимыми эффектами.
Рис. 2. Влияние ЭХАС на активность каталазы эритроцитов кроликов in vivo и на чувствительность фермента при инкубации с лизатом эритроцитов in vitro
Анализ влияния ЭХАС на активность пероксидазы эритроцитов кролика показал те же закономерности, характерные для воздействия на активность каталазы. Под влиянием электрохимически активированной воды у кроликов in vivo возрастала активность пероксидазы в эритроцитах (рис. 3).
Рис. 3. Изменение активности пероксидазы эритроцитов кроликов, получавших питье электрохимически активированной водой
Аналогичная картина активации фермента наблюдалась и в опытах in vitro при инкубации лизата эритроцитов с ЭХАС. Было установлено, что чем больше концентрация ЭХАС использовалась для преинкубации с эритроцитами, тем меньшее время было необходимо для достижения максимума активности фермента (рис. 4).
Рис. 4. Влияние ЭХАС на чувствительность пероксидазы при инкубации с лизатом эритроцитов in vitro
Заключение
В отличие от каталазы выявлены отсроченные влияния второй фазы - подавление активности пероксидазы при высоких концентрациях ЭХАС в среде и при длительном времени влияния ЭХАС на лизированные эритроциты.
Таким образом, в механизме влияния ЭХАС на активность ферментов АОЗ: СОД, каталазы и пероксидазы участвует способность электрохимически активированной воды создавать отрицательное значение ОВП, избыток электронов и генерировать образование супероксид анион радикалов (О2-), обладающего тренирующим действием на состояние активности ферментов антиокислительной системы. Длительная инкубация гемолизата эритроцитов с ЭХАС и повышение концентрации активированной воды, возможно, вызывает столь значительное повышение концентрации активных форм кислорода (АФК), окисляющих тиосодержащие активные центры ферментов, что способствует изменению их конформации и последующей инактивации.
Таким образом, в зависимости от времени, дозы и длительности действия ЭХАС способны генерировать АФК и стимулировать антиоксидантные ферменты, что является основанием для применения ЭХАС в клинической практике, в частности, для лечения гнойных и воспалительных процессов слизистых оболочек полости рта.Рецензенты:
-
Джиоев И.Г., д.м.н., профессор, зав. ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, г. Владикавказ;
-
Чопикашвили Л.В., д.б.н., профессор, зав. кафедрой зоологии, Северо-Осетинский государственный университет имени К.Л. Хе- тагурова, г. Владикавказ;
-
Быков И.М., д.м.н., профессор, зав. кафедрой фундаментальной и клинической биохимии ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России, г. Краснодар.
Работа поступила в редакцию 28.11.2011