Одной из особенностей эпидемии гриппа A/H1N1 в 2009-2010 гг. был большой удельный вес поражения нижних дыхательных путей. В свою очередь, отличительной чертой вирусной пневмонии при пандемическом гриппе стало частое развитие острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), в том числе у молодых пациентов, без выраженной сопутствующей патологии [6].
Несмотря на активное изучение ОРДС в последние годы, не решены многие вопросы этиологии и патогенеза синдрома, что приводит к разногласиям в классификации, трудностям в диагностике и лечении. Пневмонии различного генеза являются наиболее частой «прямой легочной» причиной развития ОРДС. Остается неясным, почему в одних случаях воздействие инфекционного агента ограничивается развитием пневмонии, в других - сопровождается повреждением альвеолярно-капиллярной мембраны [5]. Основным звеном развития ОРДС является выраженная адгезия нейтрофилов к эндотелию сосудов малого круга кровообращения, их аккумуляция в капиллярах и ткани легких на фоне развития синдрома системной воспалительной реакции. В то же время существуют наблюдения развития дистресс-синдрома и у больных с нейтропенией [5, 6].
В свою очередь, именно с адгезией связан феномен гиперактивации полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ), при которой происходит нерегулируемое высвобождение микробицидных соединений не в фагосому, а в экстраклеточное пространство. При этом мобилизуются как кислородзависимые бактерицидные системы нейтрофила, так и агрессивные медиаторы азурофильных гранул (эластаза, миелопероксидаза, катионные белки и др.) [2].
Особый интерес представляют катионные пептиды - дефензины (HNP-3) - ключевые молекулы врожденного иммунитета: они проявляют микробицидную активность против широкого спектра вирусов и бактерий. Кроме того, дефензины обладают рядом неоднозначных дополнительных эффектов: являются модуляторами воспаления, а также оказывают токсическое действие в отношении как трансформированных, так и неизмененных собственных клеток [3, 10].
В очаге воспаления различные клетки легких, ПМЯЛ и другие форменные элементы крови активируют аутопротективный стресс-ответ, значимым механизмом которого является накопление индуцибельного белка теплового шока HSP-70. Ранее HSP-70 считался типичным внутриклеточным протеином, однако в последнее время доказано его существование в экстрацелюллярной среде, где помимо своих протективных свойств он может стимулировать синтез провоспалительных цитокинов [4, 9].
Учитывая, что ПМЯЛ обладают неоднозначными эффектами, выяснить вклад этих клеток в развитие дистресс-синдрома может детальное изучение взаимоотношений их биологически активных веществ как основы повреждения легких. Во время прошедшей эпидемии гриппа A/H1N1 появилась уникальная возможность последовательно проследить взаимодействия медиаторов нейтрофилов на всех этапах развития процесса: от неосложненного гриппа к пневмонии, вплоть до ОРДС, что явилось целью нашей работы.
Материал и методы исследования
В исследование были включены 52 больных, находившихся на лечении в стационарах г. Читы во время эпидемии гриппа 2009-2010 гг., обоего пола, в возрасте от 19 до 40 лет. Работа проводилась с одобрения локального этического комитета, после получения информированного согласия пациентов. Диагноз гриппа A/H1N1 был верифицирован путем обнаружения вируса в назофарингиальных мазках (методом ПЦР) либо в случае нарастания в сыворотке крови титра антител к его антигенам. Для сравнения исследовались три группы: 1-я - больные гриппом тяжелого течения в форме трахеобронхита без осложнений (n = 16); 2-я - больные гриппом, осложненным внебольничной полисегментарной пневмонией средней степени тяжести (n = 20); 3-ю группу составили больные гриппом, осложненным тяжелой пневмонией, приведшей к развитию ОРДС I-II стадий (n = 16). ОРДС диагностировали в соответствии с критериями, рекомендованными Американо-Европейской Согласительной Конференцией, его стадии выделяли по методике J.F. Murray [5]. У 14 из 16 больных последней группы наступил летальный исход от нарастающей острой дыхательной недостаточности, у всех погибших диагноз был подтвержден морфологическим исследованием. По результатам аутопсий вирусная пневмония выявлялась у 75 % умерших, вирусно-бактериальная - у 24,5 %, наиболее частой причиной ко-инфекции был Staphylococcus aureus. В качестве контроля использовалась кровь доноров соответствующего возраста (n = 16).
Объектом исследования служила плазма крови, которая забиралась на 2-5 сутки болезни. У части здоровых и пациентов дополнительно определялось внутриклеточное содержание медиаторов. Для этого из крови испытуемых нейтрофильные гранулоциты выделялись на двойном градиенте плотности фиколл-верографина: 1,077/1,097 г/мл; чистота фракции составляла 92-94 %. Выделенные нейтрофилы разделяли на аликвоты по 10 ± 5 тысяч клеток в 0,2 мл физиологического раствора и путем замораживания-оттаивания из них получали лизаты, в которых определяли искомые вещества. Получение клеток и плазмы проводились параллельно из одних порций крови. Концентрации исследуемых веществ определяли методом иммуноферментного анализа фирменными наборами по протоколам производителей: HNP-3, эластазы и миелопероксидазы (МРО) - «Hycult biotech», Нидерланды; индуцибельного HSP-70 - «Assay Designs», США.
Статистическая обработка проведена с использованием пакета программ BIOSTAT. При сравнении групп использовался критерий Манна-Уитни, различия считали значимыми при р ≤ 0,05. Данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного (25-й и 75-й персентили) интервала - указан в скобках.
Результаты исследования и их обсуждение
На этапах развития воспалительного процесса, вызванного гриппозной инфекцией, динамика содержания медиаторов нейтрофилов в плазме крови отличалась: изменения HNP-3 имели не линейный характер, уровень эластазы и МРО нарастал (табл. 1). Развитие тяжелого несложненного гриппа сопровождалось более чем вдвое увеличением содержания в крови α-дефензинов (р = 0,000). При присоединении пневмонии концентрация HNP-3 уменьшалась (р = 0,045), но оставалась выше, чем у здоровых (р = 0,006). В случае развития ОРДС количество HNP-3 было таким же, как у пациентов с пневмонией (р = 0,85).
Концентрация нейтрофильной эластазы уже при неосложненном гриппе была почти вдвое выше, чем у здоровых лиц (р = 0,002), а при развитии пневмонии она увеличивалась в 4 раза (р = 0,000). При этом формирование на фоне тяжелой пневмонии ОРДС I-II стадий не сопровождалось дополнительным ростом уровня фермента (р = 0,81). Содержание МРО в плазме крови также увеличивалось в ряду: здоровые - больные неосложненным гриппом (р = 0,004) - пациенты с пневмонией (р = 0,01), при развитии ОРДС оно оставалось таким же, как и у больных пневмонией средней степени тяжести (р = 0,68). При этом степень прироста концентрации МРО была меньшей, чем эластазы: не превышала 50 % от содержания медиатора у здоровых. Уровень индуцибельного HSP-70 в крови больных был значительно выше (в 6-7 раз), чем у здоровых, но между собой группы по количеству протеина не различались.
Таблица 1
Концентрация медиаторов нейтрофилов и HSP-70 в плазме крови
на этапах развития заболевания (Ме (25-й 75-й))
|
Медиатор |
Здоровые (n = 16) |
Неосложненный грипп (n = 16) |
Пневмония (n = 20) |
ОРДС (n = 16) |
|
HNP-3, мкг/мл |
1,4 (0,5; 2,2) |
3,5 (3,2; 9,9) р = 0,000* |
2,4 (1,8; 3,5) р = 0,006* р1 = 0,045* |
2,3 (1,9; 3,8) р = 0,013* р1 = 0,023* р2 = 0,85 |
|
Эластаза, нг/мл |
57,8 (16; 66,5) |
99,9 (79,2; 134,9) р = 0,002* |
206,1 (119,3; 265,4) р = 0,000* р1 = 0,008* |
199,4 (137,7; 271,9) р = 0,000* р1 = 0,004* р2 = 0,81 |
|
МПО, нг/мл |
71,1 (66,7; 80,3) |
84,8 (79,8; 92,9) р = 0,004* |
102,7 (92,2; 142,3) р = 0,000* р1 = 0,01* |
111,9 (78,4; 122,6) р = 0,002* р1 = 0,05* р2 = 0,68 |
|
HSP-70 индуцибельный, нг/мл |
0,13 (0,1; 0,5) |
0,85 (0,4; 0,9) р = 0,004* |
0,88 (0,7; 0,9) р = 0,000* р1 = 0,75 |
0,82 (0,5; 1,3) р = 0,004* р1 = 0,21 р2 = 0,60 |
Примечание:
р - значение различий по сравнению со здоровыми;
р1 - значение различий по сравнению с больными неосложненным гриппом;
р2 - значение различий по сравнению с больными пневмонией средней степени тяжести;
* - значимые различия.
Полученные результаты, на наш взгляд, свидетельствуют о следующих процессах. Как известно, нейтрофильные лейкоциты являются первым эшелоном защиты организма от инфекции, трансформированных и поврежденных клеток. Интенсивная адгезия и гиперактивация нейтрофилов приводит к активному высвобождению медиаторов во внеклеточное пространство [2], поэтому возможен зафиксированный нами рост их концентрации в системном кровотоке.
Учитывая отсутствие различий в концентрации медиаторов в плазме крови между пациентами с неосложненной пневмонией и больными ОРДС, возникло предположение о возможных различиях их внутриклеточного содержания. Для подтверждения гипотезы в этих группах параллельно с исследованием плазмы определялся уровень медиаторов в лизатах ПМЯЛ. Динамика внутриклеточных соотношений исследуемых веществ в процессе развития заболевания отличалась от таковой в плазме крови: концентрация HNP-3 и МРО увеличивалась; эластазы, напротив, резко снижалась. Продукция индуцибельного HSP-70 в нейтрофилах больных пневмонией, по сравнению со здоровыми, нарастала (р = 0,04), но при развитии ОРДС оставалась на уровне пациентов с неосложненной пневмонией (р = 0,90) (табл. 2).
Зарегистрированные нами изменения внутриклеточного содержания биологически активных веществ, вероятно, доказывают участие в развитии пневмонии и дистресс-синдрома следующих механизмов. Прежде всего, вызывает вопрос сама возможность повышения интрацелюлярной концентрации медиаторов в нейтрофильных гранулоцитах, так как они поступают в кровеносное русло предельно дифференцированными клетками. Известно, что азурофильные гранулы образуются первыми в процессе созревания ПМЯЛ, еще на стадии промиелоцита, но в ряде работ показано, что способность к синтезу дефензинов у зрелых нейтрофилов сохраняется [11]. В доступной нам литературе мы не обнаружили данных о синтезе МРО в сегментоядерном нейтрофиле, но зафиксированный прирост внутриклеточной концентрации этого фермента доказывает такую возможность. С другой стороны, при развитии системного воспалительного ответа описано усиление синтеза противомикробных пептидов в макрофагах посредством активации провоспалительными цитокинами транскрипционного фактора NF-кВ [5, 8]. NF-кВ универсален, он присутствует и в ПМЯЛ [11], поэтому схожий механизм активации синтетических процессов, вероятно, возможен и в них.
Таблица 2
Концентрация медиаторов в лизатах нейтрофилов (Ме (25-й; 75-й))
|
Медиатор |
Здоровые (n = 12) |
Пневмония (n = 14) |
ОРДС (n = 10) |
|
HNP-3, мкг/мл |
2,5 (2,3; 2,95) |
3,4 (3,1; 4,1) р = 0,001* |
5,3 (4,5; 6,0) р = 0,000* р1 = 0,009* |
|
Эластаза, нг/мл |
35,9 (31,0; 98,7) |
6,3 (4,7; 37,0) р = 0,09 |
2,3 (0; 3,08) р = 0,000* р1 = 0,001* |
|
МРО (нг/мл) |
88,1 (85,3; 91,1) |
97,4 (90,0; 98,1) р = 0,013* |
106,7 (102,6; 118,5) р = 0,002* р1 = 0,015* |
|
HSP-70 индуцибельный, нг/мл |
1,5 (1,0; 1,8) |
2,1 (1,1; 2,3) р = 0,04* |
1,7 (1,6; 2,0) р = 0,02* р1 = 0,90 |
Примечания:
р - значение различий по сравнению со здоровыми;
р1 - значение различий по сравнению с больными пневмонией средней степени тяжести;
* - значимые различия.
При высокопатогенном гриппе A/H1N1 даже в случаях относительно локального процесса (неосложненный грипп в форме трахеобронхита) мы наблюдали повышение общего микробицидного потенциала плазмы крови: нарастал уровень всех исследуемых медиаторов, причем самым значительным было увеличение дефензинов (в 2,5 раза). Можно предположить, что при этой форме заболевания уничтожение вируса гриппа совершалось за счет синергического действия, в том числе исследуемых веществ [1-3]. Безусловно, при указанных процессах происходило воздействие медиаторов ПМЯЛ и на собственные структуры, но, учитывая, что у этих пациентов не было осложнений, оно уравновешивалось, в том числе активацией синтеза различными клетками индуцибельного HSP-70.
Легочная гемоциркуляция уникальна, так как здесь сосредоточен основной пул маргинальных нейтрофилов, и их эмиграция идет преимущественно из капилляров [2], что происходило при неосложненной пневмонии и в большей степени при ОРДС. Одним из механизмов повреждения ткани легких при пневмонии являлся дополнительный, по сравнению с неосложненным гриппом, прирост в плазме крови концентраций эластазы и МРО, причем последний фермент в нейтрофилах продолжал синтезироваться, увеличивая их «аутоагрессивные возможности». Резкое снижение внутриклеточной эластазы (почти в шесть раз) при одновременном самом выраженном росте ее концентрации в плазме, скорее всего, связано с активным выходом фермента из клеток. При развитии пневмонии уменьшение HNP-3 в плазме с параллельным ростом их внутриклеточного содержания, вероятно, запускало следующие звенья патогенеза. С одной стороны, уничтожение возбудителя нейтрофилами путем фагоцитоза, скорее всего, не страдало, но при такой динамике плазменной концентрации дефензинов ослабевал общий микробицидный потенциал, что приводило к активному размножению вируса. С другой стороны, действие HNP-3 не ограничивается только противомикробными свойствами. Дефензины являются мощными хемоаттрактантами для моноцитов, а также обеспечивают эффекторную фазу адаптивного иммунитета посредством рекрутирования Т-лимфоцитов [3, 10]. Эластаза и МРО, напротив, разрушая собственные структуры, фрагментируя при взаимодействии α1-антитрипсин [1], увеличивают в очаге концентрацию низкомолекулярных пептидов, привлекающих сюда новые генерации ПМЯЛ. В итоге уменьшение содержания в крови HNP-3 на фоне прироста эластазы и МРО, возможно, приводило к нарушению смены клеточных субпопуляций в очаге воспаления легочной паренхимы, увеличению степени ее нейтрофильной инфильтрации. В свою очередь, причина уменьшения плазменной концентрации дефензинов с одновременным увеличением их внури нейтрофилов при развитии пневмонии не ясна и требует дальнейшего исследования.
Избыточная аккумуляция ПМЯЛ в легочных капиллярах и паренхиме приводит не только к уничтожению возбудителей инфекции, но и повреждению компонентов сурфактанта, базальной мембраны альвеол, эндотелиоцитов. Нарушение целостности альвеолярно-капиллярной мембраны на ранних этапах ОРДС происходило при отсутствии роста в крови концентрации медиаторов азурофильных гранул (их дополнительного увеличения не было). С другой стороны, «агрессивный потенциал» нейтрофилов продолжал повышаться (в большей степени за счет HNP-3), поэтому полностью исключить участие этого механизма в нарушении целостности аэрогематического барьера в последующем невозможно. Скорее всего, этот феномен объясняет случаи развития ОРДС при нормальном уровне лейкоцитов и даже нейтропении [5]. Вероятно, при инициации ОРДС возникал дефицит как локальных легочных, так и общих механизмов, защищающих от избыточной вторичной альтерации медиаторами нейтрофилов, что требует дополнительного изучения.
Отсутствие прироста уровня индуцибельного HSP-70 (как в крови, так и в ПМЯЛ) также вносило свой вклад в развитие дистресс-синдрома. На экспериментальной модели сепсис-индуцированного ОРДС показано: дополнительное введение животным HSP-70 приводит к уменьшению выработки провоспалительных цитокинов, препятствует активации ПМЯЛ и подавляет их миграцию в легочную ткань [7]. Наше наблюдение демонстрирует, что при развитии на фоне пневмонии дистресс-синдрома «желаемого» увеличения синтеза HSP-70 и его протективных эффектов не развивается.
Выводы
1. Развитие пневмонии и ОРДС I-II стадий на фоне гриппа A/H1N1 сопровождается ростом цитотоксических возможностей нейтрофилов за счет синтеза HNP-3 и МРО, причем при ОРДС эти процессы более выражены.
2. Одним из механизмов формирования пневмонии на фоне гриппа является уменьшение содержания в плазме крови HNP-3 при одновременном повышении нейтрофильной эластазы и МРО.
3. При развитии ОРДС в плазме крови концентрация медиаторов азурофильных гранул нейтрофилов остается такой же, как и при пневмонии средней степени тяжести.
4. При формировании ОРДС уровень индуцибельного HSP-70 и в плазме крови, и в нейтрофилах остается таким же, как и при среднетяжелой пневмонии.
Рецензенты:
Бишарова Г.И., д.м.н., профессор, директор Читинского филиала ГУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН», г. Чита;
Патеюк А.В. д.м.н., профессор кафедры основ медицины ФГБОУ ВПО «Забайкальский государственный университет», г. Чита.
Работа поступила в редакцию 27.12.2011.