Проявление стрессобусловленных изменений в деятельности функциональных систем организма ограничивается рядом стресс-лимитирующих систем, одной из которых является опиоидергическая система. Экспериментальные исследования свидетельствуют, что синтетические аналоги опиоидных пептидов обладают кардиоваскулярной активностью [6] и в том числе способны корректировать стрессобусловленные изменения сосудистого тонуса [1]. Вероятным механизмом такого действия может быть изменение уровня эндотелиальных вазоактивных факторов - оксида азота (NO) и эндотелина-1 (ЭТ-1) на фоне активации опиатных рецепторов [2, 5].
Первым синтетическим аналогом эндогенных опиоидных пептидов, разрешённым к клиническому применению, является даларгиин - аналог лей-энкефалина, неселективный агонист µ- и δ-опиатных рецепторов (ОР). Однако, согласно исследованиям, в сыворотке крови человека даларгин подвергается быстрой деградации с образованием более стабильных пента- и тетрапептидов, поэтому был создан ряд структурных аналогов, за счёт модификации молекулы даларгина, с целью придания ей большей устойчивости к деградации [7].
Цель исследования - изучить влияние неселективного агониста µ- и δ-ОР даларгина и его стабилизированного аналога на механизмы эндотелиальной коррекции стрессобусловленного сосудистого тонуса.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования служили половозрелые бодрствующие самцы крыс популяции Wistar. Острый стресс моделировали путём иммобилизации животных в камере без жёсткой фиксации в течение часа [8]. Тонус сосудов измеряли методом тетраполярной реовазографии с помощью многофункционального компьютерного диагностического комплекса «Диастом-01». Запись реовазограмм хвостовой артерии крысы проводили на 5-й, 15-й, 30-й, 45-й, 60-й мин эксперимента, что позволило в динамике проследить стрессобусловленные изменения сосудистого тонуса. Функциональное состояние периферических сосудов оценивали с использованием количественных показателей: индекса периферического сопротивления (ИПС), индекса эластичности (ИЭ) [3].
Исследование включало 8 серий экспериментов по 15 особей в каждой серии. Группа интактных животных не подвергалась каким-либо воздействиям. Контрольной группе животных внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в объёме 0,9 мл. Животным экспериментальных групп вводили даларгин (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg) и его стабилизированный аналог (Tyr-D-Ala-Gly-МеPhe-Leu-Arg), модификация которого проведена за счёт N-метилирования фенилаланинового остатка. Пептиды вводили внутрибрюшинно в объёме 0,9 мл физиологического раствора в дозах, не проникающих через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) (10 и 100 мкг/кг) и проникающих через ГЭБ (1000 мкг/кг) [9]. Даларгин и его стабилизированный аналог синтезированы в лаборатории синтеза пептидов РКНП МЗ РФ (рук. канд. хим. наук Беспалова Ж.Д.).
Для измерения концентрации NO, ЭТ-1, кортикостерона в плазме крови, стабилизированной ЭДТА, использовали наборы для количественного определения окиси азота (R&D systems), эндотелина (1-21) (Biomedica), кортикостерона (Assay Designs) в биологических жидкостях.
Полученные количественные данные описывали с помощью медианы и процентилей: Ме (P25-75). Оценку статистических различий внутри групп проводили с использованием критерия Фридмана, между группами с помощью критерия Краскела-Уоллиса, с последующими апостериорными сравнениями с использованием критериев Вилкоксона и Манна-Уитни соответственно. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05 [10].
Результаты исследования и их обсуждение
На модели часовой иммобилизации выявлена активация гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы, которая проявлялась в повышении содержания кортикостерона в плазме крови контрольных животных на 129,9 % (р = 0,002) по сравнению с интактными животными. В данных условиях наблюдался стрессобусловленный рост периферического тонуса сосудов и снижение их эластичности. Так, ИПС к 60-й мин эксперимента возрастал на 82,8 % (р = 0,001), а ИЭ снижался на 49,1 % (р = 0,001) по сравнению с 5-й мин иммобилизации (рис. 1, 2).
Рис. 1. Стрессобусловленные изменения ИПС
на фоне введения опиоидных пептидов в разных дозах
Рис. 2. Стрессобусловленные изменения ИЭ на фоне введения опиоидных пептидов в разных дозах
Изменялся уровень вазоактивных эндотелиальных факторов: происходило некоторое снижение уровня NO на 13,1 % и увеличение ЭТ-1 на 8,5 % по сравнению с фоновыми показателями (рис. 3, 4).
Активация ОР оказывала протективный эффект на стрессобусловленный сосудистый тонус. При введении даларгина в дозе 10 мкг/кг снижение стрессобусловленного роста сосудистого тонуса наблюдалось с 15 мин эксперимента. ИПС на 15-й мин стрессирования был ниже контрольного значения на 23,1 % (p = 0,001). Такое значение показателя стабильно сдерживалось до 45-й мин и лишь к концу эксперимента вновь возрастало, хотя и оставалось ниже контрольного значения на 13,5 % (p = 0,001). ИЭ, снижаясь к концу иммобилизации, остался выше контрольного значения на 51,9 % (p = 0,000). На фоне введения даларгина в дозе 100 мкг/кг уже с 5-й мин иммобилизации наблюдалось выраженное снижение ИПС по сравнению с контролем на 22,8 % (p = 0,000). В условиях иммобилизации наблюдался постепенный рост ИПС, но к 60-й мин стрессирования он остался ниже контрольного уровня на 18,3 % (p = 0,02) (рис. 3). ИЭ был выше контрольного значения с 5-й мин на 10,9 % (p = 0,04), а к 60-й мин - на 33,7 % (p = 0,000) (см. рис. 1, 2).
Рис. 3. Изменения уровня NO на фоне введения
опиоидных пептидов в разных дозах:
1 - фон; 2 - стресс; 3 - даларгин 10 мкг/кг;
4 - даларгин 100 мкг/кг;
5 - даларгин 1000 мкг/кг; 6 - аналог 10 мкг/кг;
7 - аналог 100 мкг/кг; 8 - аналог 1000 мкг/кг
Рис. 4. Изменения уровня ЭТ-1 на фоне введения
опиоидных пептидов в разных дозах:
1 - фон; 2 - стресс; 3 - даларгин 10 мкг/кг;
4 - даларгин 100 мкг/кг;
5 - даларгин 1000 мкг/кг; 6 - аналог 10 мкг/кг;
7 - аналог 100 мкг/кг; 8 - аналог 1000 мкг/кг
Анализ уровня эндотелиальных факторов показал, что при введении даларгина в дозе 100 мкг/кг происходило заметное увеличение NO к концу иммобилизации на 73,7 % (p = 0,003) по сравнению с фоновым уровнем и на 100,0 % (p = 0,002) по сравнению со стрессовым значением этого показателя (см. рис. 3). Содержание ЭТ-1 при этом заметно не изменилось (см. рис. 4). Кроме того, на фоне введения даларгина в данной дозе наблюдалась тенденция к снижению уровня кортикостерона на 9,0 % по отношению к стрессовому показателю. Снижение тонуса сосудов в ответ на введение даларгина выявили и другие исследователи. Такое действие пептида связывают с активацией NO-синтазы в эндотелии сосудов [5]. При введении пептида в дозе 10 мкг/кг заметных изменений в содержании NO и ЭТ-1 к концу стрессирования не выявлено. Однако в данной дозе пептид всё же сдерживал рост тонуса сосудов в условиях стресса. Вероятно, низкая стабильность даларгина и малая доза действующего вещества привели к активации небольшого количества опиатных рецепторов. Такая непродолжительная активация смогла запустить эндотелиальные механизмы, способствовавшие снижению тонуса сосудов в условиях стресса.
Активация периферических ОР аналогом даларгина сопровождалась снижением стрессобусловленного сосудистого тонуса на протяжении всего эксперимента. При введении аналога в дозах 10 и 100 мкг/кг ИПС уже с 5-й мин был ниже контрольного на 17,8 % (p = 0,005) и 22,9 % (p = 0,000), а на 60-й мин - на 11,2 % (p = 0,000) и 8,2 % (p = 0,001) соответственно (см. рис. 1). ИЭ в этих условиях к концу иммобилизации остался выше стрессового уровня на 23,6 % (p = 0,029) и 18,6 % (p = 0,019) соответственно (см. рис. 2). На фоне введения аналога в дозе 100 мкг/кг наблюдали снижение кортикостерона на 18,1 % (р = 0,041).
Введение аналога даларгина сопровождалось увеличением уровня NO. Так, активация ОР пептидом в дозе 10 мкг/кг приводила к росту уровня NO как по сравнению с фоновым показателем на 53 % (p = 0,000), так и со стрессовым значением этого показателя на 76,0 % (p = 0,000). Введение аналога в дозе 100 мкг/кг также сопровождалось увеличением NO на 75,3 % (p = 0,000) по сравнению с фоновыми значениями и на 101,7 % (p = 0,000) со стрессовым уровнем (см. рис. 3). Изменения активности эндотелиновой системы в данных условиях не наблюдалось (см. рис. 4). Следовательно, снижение стрессобусловленного тонуса сосудов на фоне введения аналога даларгина в данных дозах могло быть связано с увеличением уровня вазодилататора NO. Таким образом, использование стабилизированного аналога даларгина позволило подтвердить предположение о том, что протективный эффект активации µ- и δ-ОР в дозе 10 мкг/кг также связан с активацией синтеза NO.
Введение даларгина и его стабилизированного аналога в дозе 1000 мкг/кг сопровождалось провокационным эффектом на тонус сосудов в условиях стресса (см. рис. 1, 2). Такой эффект известен для регуляторных пептидов, когда при превышении оптимальной дозы происходит уменьшение терапевтического эффекта пептида, вплоть до его исчезновения [9]. При введении даларгина на фоне острого стресса уровень NO оказался ниже фонового и стрессового значений на 24,0 % (p = 0,003) и на 12,8 % (p = 0,02) соответственно, а концентрация ЭТ-1, наоборот, выше фонового на 18,4 % (р = 0,036) и несколько выше стрессового уровня (на 7,3 %) (см. рис. 3, 4). Следовательно, в данных условиях увеличение вазоконстрикторных и ослабление вазодилататорных факторов могло быть причиной увеличения стрессобусловленного тонуса сосудов. На фоне введения аналога даларгина, наоборот, наблюдали увеличение уровня NO. Известно, что стимуляция рецепторов высокими дозами агонистов может приводить к снижению афинности или плотности рецепторов, что и могло явиться возможной причиной снижения уровня NO в ответ на введение даларгина. Стабилизированный аналог, скорость деградации которого могла быть ниже, чем у даларгина, смог взаимодействовать с рецепторами после восстановления их плотности или афинности. Cледствием такого взаимодействия вероятно и явился рост уровня NO (на 61,6 %, р = 0,003; 86 %, р = 0,000 в сравнении с фоном и стрессом соответственно) к концу иммобилизации.
Учитывая, что даларгин способен преодолевать ГЭБ в дозах от 1000 мкг/кг и выше [9], при периферическом введении его в дозе 1 мг/кг происходит активация не только периферических, но и центральных ОР. Гипертензивный эффект при активации центральных µ- и δ-ОР наблюдали и другие авторы [4].
Выводы
1. Активация ОР даларгином и его структурным аналогом в дозах, не проникающих через ГЭБ, сопровождалась снижением роста тонуса сосудов в условиях иммобилизационного стресса. Изменения уровня вазоактивных факторов (NO и ЭТ-1) на фоне активации ОР пептидами в данных дозах свидетельствуют о преимущественной роли NO в протективном эффекте опиоидов на стрессобусловленную вазоконстрикцию.
2. Активация ОР даларгином и его структурным аналогом в дозе, проникающей через ГЭБ, приводила к увеличению стрессобусловленного тонуса сосудов. Такой эффект даларгина сопровождался снижением NO и некоторым ростом ЭТ-1, в то время как провокационный эффект аналога сопровождался ростом уровня NO.
3. Стабилизация молекулы даларгина путём N-метилирования остатка фенилаланина приводила к более выраженному увеличению NO по сравнению с даларгином в дозах 10 и 1000 мкг/кг.
Рецензенты:
Соколова Л.В., д.б.н., профессор кафедры биологии и экологии человека Института естественных наук и биомедицины САФУ им. М.В. Ломоносова, г. Архангельск;
Щеголева Л.С., д.б.н., доцент, директор Учреждения РАН Института физиологии природных адаптаций УрО РАН, г. Архангельск.
Работа поступила в редакцию 10.11.2011.