В рамках расширения ассортимента и создания корригированных лекарственных форм пижмы ранее нами был разработан состав сиропа со спиртовым экстрактом пижмы 1:1. В медицине настой соцветий пижмы используют как противоглистное и желчегонное средство. Большинство исследователей связывают фармакологическую активность препаратов пижмы с наличием флавоноидов и эфирных масел.
Целью данного исследования явилась разработка методики количественного определения флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в сиропе пижмы.
При разработке методики руководствовались методиками количественного определения суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот, приведенными в НД на сырье «цветки пижмы» и препарат «Танацехол» [2, 4, 5]. Предварительно был измерен УФ-спектр раствора сиропа. В УФ-спектре раствора сиропа, приготовленного для количественного определения (рис. 5), в области от 230 до 400 нм имеются максимумы поглощения при 255 ± 3 и 345 ± 3 нм, плечо при 300-312 нм и минимум при 277 ± 3 нм (рис. 1).
На основании полученных результатов подобраны оптимальные условия и предложена методика определения методом прямой спектрофотометрии суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в сиропе с экстрактом цветков пижмы с использованием в качестве стандартного образца лютеолина.
Методика. Около 0,5 г препарата (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в буферном растворе (рН 9,0), доводят тем же растворителем до метки, перемешивают. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 350 нм относительно буферного раствора (рН 9,0). Параллельно в тех же условиях измеряют оптическую плотность раствора ГСО лютеолина.
Содержание суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в пересчёте на лютеолин в % (Х) рассчитывают по формуле:
где D - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 - оптическая плотность раствора РСО лютеолина; m - навеска сиропа в г; m0 - навеска лютеолина в г.
Рис. 1. Спектр поглощения сиропа с экстрактом цветков пижмы в буферном растворе (рН 9,0)
Валидация методики проводилась по следующим параметрам: линейности, повторяемости и правильности [1, 3].
Определение линейности проводили на 7 уровнях концентрации от теоретического содержания суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в пересчёте на лютеолин в сиропе с экстрактом цветков пижмы. Растворы готовили путём уменьшения и увеличения используемой в методике количественного определения навески для получения концентраций 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 % соответственно и измеряли их оптическую плотность (табл. 1).
Критерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции. Если его величина близка единице, то совокупность данных можно описать прямой линией. Нижний допустимый предел этой величины 0,99. Вычисление коэффициента корреляции проводили с помощью программы Microsoft Excel 2010 (рис. 2).
Таблица 1 Определение линейности разработанной методики
|
Навеска, % |
Навеска, г |
Оптическая плотность, D |
Содержание суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в пересчёте на лютеолин, мкг/мл |
|
50 |
0,250 |
0,2755 |
3,81 |
|
75 |
0,300 |
0,3820 |
5,42 |
|
100 |
0,400 |
0,5196 |
7,20 |
|
125 |
0,500 |
0,6443 |
8,98 |
|
150 |
0,600 |
0,7752 |
10,78 |
|
175 |
0,700 |
0,8826 |
12,26 |
Рис. 2. Зависимость оптической плотности от концентрации лютеолина
Из рис. 2 видно, что почти все экспериментальные точки лежат на линии тренда. Значение коэффициента корреляции лежит в пределе 0,99 ≤ R2 ≥ 1,0, следовательно, область линейной зависимости наблюдается при концентрациях лютеолина от 3,81 до 12,26 мкг/мл.Прецизионность методики оценивали по первому уровню - повторяемости, которую определяли на одном образце экстракта в 6 повторностях (табл. 2).
Таблица 2 Определение повторяемости разработанной методики
|
Результат анализа % |
(Xi - X‾) |
(Xi - X‾)2 |
Метрологические характеристики |
|
0,16 |
-0,0024 |
0,0000060 |
X‾ =0,16 SD = 0,004 RSD = 2,37 % |
|
0,16 |
-0,0023 |
0,0000054 |
|
|
0,16 |
-0,0013 |
0,0000016 |
|
|
0,17 |
0,0052 |
0,0000265 |
|
|
0,16 |
-0,0037 |
0,0000133 |
|
|
0,17 |
0,0045 |
0,0000205 |
Относительное стандартное отклонение равно 2,37 % и не превышает величину RSD, предусмотренную для спектрофотометрических методов (3 %).
Таблица 3 Результаты определения величины случайной погрешности спектрофотометрического определения суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот
|
Навеска, г |
Оптическая плотность |
Содержание, % |
Метрологические характеристики |
|
0,4920 |
0,5728 |
0,16 |
X‾ =0,16 S = 0,0038 S X‾ = 0,0016 Δx‾ = 0,0040 ε = ±2,48 % |
|
0,4992 |
0,5816 |
0,16 |
|
|
0,5260 |
0,6169 |
0,16 |
|
|
0,5026 |
0,6130 |
0,17 |
|
|
0,5380 |
0,6216 |
0,16 |
|
|
0,5178 |
0,6292 |
0,17 |
Правильность методики устанавливали путём измерения количественного содержания суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в пересчёте на лютеолин в растворах, полученных путём добавления раствора стандартного образца с известным содержанием лютеолина к раствору сиропа с экстрактом цветков пижмы (метод добавок). Из каждой пробы делали по три независимых измерения. Результаты определений представлены на рис. 3 и в табл. 4.
Таблица 4 Определение правильности методики (результаты опытов с добавками) количественного определения суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в сиропе с экстрактом цветков пижмы
|
Содержание в исходном растворе сиропа, мкг/мл |
Добавлено РСО лютеолина, мкг |
Расчетное содержание, мкг/мл |
Полученное содержание, мкг/мл |
Открываемость, R, % |
|
31,296 |
10,4 |
6,68 |
6,65 |
99,60 |
|
31,296 |
10,4 |
6,68 |
6,58 |
98,58 |
|
31,296 |
10,4 |
6,68 |
6,57 |
98,29 |
|
31,296 |
52,0 |
8,34 |
8,50 |
101,97 |
|
31,296 |
52,0 |
8,34 |
8,45 |
101,26 |
|
31,296 |
52,0 |
8,34 |
8,33 |
99,90 |
|
31,296 |
104,0 |
10,42 |
10,80 |
103,61 |
|
31,296 |
104,0 |
10,42 |
10,59 |
101,66 |
|
31,296 |
104,0 |
10,42 |
10,78 |
103,42 |
|
Метрологические характеристики: X‾ =100,92; SD = 1,951; RSD = 1,93 % |
||||
Рис. 3. Зависимость оптической плотности от концентрации лютеолина при определении правильности методики количественного определения флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в сиропе с экстрактом цветков пижмы
Критерий приемлемости - средний процент открываемости, скорректированный на 100 %, и её средняя величина должна находиться в пределах 97-103 % (согласно рекомендациям американской ассоциации аналитической химии (АОАС) при содержании анализируемого вещества больше 1 %). В разработанной методике средний процент открываемости составил 100,92 %, а относительное стандартное отклонение не превышает 3 %, что соответствует величине RSD, оптимальной для данного метода анализа.
На основании полученных результатов можно сделать вывод о пригодности данной методики для оценки качества сиропа с экстрактом цветков пижмы.
Выводы
-
Методом прямой спектрофотомерии установлено содержание суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в сиропе пижмы.
-
Проведена валидация разработанной методики по параметрам: воспроизводимость, повторяемость и правильность.
Рецензенты:
-
Молчанов Г.И., д.фарм.н., профессор, профессор кафедры экономики и управления ГОУ ВПО «Российский государственный торгово-экономический университет» Пятигорский филиал, г. Пятигорск;
-
Маршалкин М.Ф., д.х.н., профессор кафедры химических дисциплин, Пятигорского технологического института, г. Пятигорск.
Работа поступила в редакцию 12.12.2011.