Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В настоящее время в результате селективного действия антибактериальных препаратов и эволюции микроорганизмов происходит качественное изменение этиологической структуры гнойной инфекции, заключающееся в превалировании условно патогенных микроорганизмов. Данные разных авторов свидетельствуют о возрастании удельного веса грамнегативной микрофлоры, среди которой особое внимание заслуживает синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa).

Синегнойная палочка является одним из основных возбудителей гнойных хирургических инфекций. Среди грамнегативных возбудителей раневой инфекции доля Ps. aeruginosa составляет около 24 %. Причем в 7,4 % случаев она выделяется у больных травматологических стационаров [5, 6].

Вследствие наличия у Ps. aeruginosa различных факторов вирулентности инфекции, вызываемые ею, потенциально опасны и обычно характеризуются тяжелым, иногда молниеносным течением.

Ps. aeruginosa обладает способностью продуцировать бета-лактамазы I типа. При возникновении спонтанных генетических мутаций нестабильные антибиотики, инактивирующиеся ферментами I типа, ингибируют чувствительные немутантные штаммы микроорганизмов, но при этом позволяют размножаться устойчивым мутантным штаммам, которые становятся превалирующей флорой [7]. Видимо, это и является причиной частого выделения синегнойной палочки из патологического материала, взятого у больных с хронической инфекцией.

Вследствие наличия у Ps. aeruginosa различных механизмов резистентности нередки случаи выделения штаммов этого микроорганизма с множественной устойчивостью к большинству, а иногда и ко всем антибиотикам. Поэтому лечение инфекций, вызванных Ps. aeruginosa, достаточно сложно и малоэффективно.

Характерной особенностью Ps. aeruginosa является быстрое формирование устойчивости в процессе лечения, что диктует необходимость поиска новых, альтернативных антимикробных препаратов. В этом отношении металлы в виде наночастиц являются одним из перспективных претендентов на создание нового класса антибактериальных средств, поскольку они обладают низкой токсичностью, пролонгированным действием; в биотических дозах стимулируют функциональную активность регуляторных систем [4]. Нанопорошки металлов проявляют ярко выраженную биологическую активность, в том числе бактериостатическое и бактерицидное действия. Имеются отдельные примеры изучения бактерицидного эффекта наночастиц серебра, цинка, железа, меди на штаммы E.coli, St.aureus и Ps. aeruginosa [1, 2, 3].

Антибактериальное действие наночастиц никеля изучено недостаточно. Имеются единичные публикации о влиянии данного металла на отдельных представителей микрофлоры [8, 9]. Так, K. Yoon et al. были проведены исследования антимикробного действия наночастиц никеля и серебра на стандартные штаммы E. coli и B. subtilis, где наночастицы никеля продемонстрировали высокую антибактериальную активность [9]. Таким образом, представляется перспективным дальнейшее изучение антимикробного действия наночастиц никеля на клинические штаммы Ps. aeruginosa.

Исследование производилось на 20 штаммах Ps. aeruginosa, выделенных от больных травматолого-ортопедического профиля, находящихся на лечении в Саратовском научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии (СарНИИТО).

Для получения исходного вещества на аналитических весах готовили навеску наночастиц никеля, соответствующую 10 мг вещества, и суспензировали ее в 1 мл физиологического раствора. Затем готовили последовательные разведения препарата до 10^-3 мг/мл. Таким образом, получали следующие концентрации наночастиц 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1 мг/мл.

Для инокуляции использовали стандартную микробную взвесь, эквивалентную 0,1 ЕД по стандарту МакФарланда, разведенную в 100 раз в физиологическом растворе. По 100 мкл инокулюма вносили в каждую пробирку, содержащего по 100 мкл соответствующего разведения наночастиц, и в одну пробирку с 900 мкл физиологического раствора без наночастиц. Конечная концентрация микроорганизмов в каждой пробирке достигала 30 000 КОЕ/мл.

Полученную взвесь инкубировали 30, 60, 90 и 120 минут при комнатной температуре. После чего, по 100 мкл каждого образца засевали на чашки с твердой питательной средой и помещали в термостат при 37 °С на 24 часа. На следующий день производились подсчет колоний и исследование биохимических показателей жизнедеятельности микроорганизмов в опытной (после 60-минутного воздействия наночастиц никеля в концентрации 1 мг/мл) и контрольной группах.

Изучения изменение биохимических свойств бактерий проводили с использованием NEFERMtest24 (La Chema, Чехия).

В исследовании использовали наночастицы, полученные Саратовским плазмохимическим комплексом ФГУП РФ ГНЦ ГНИИ химической технологии элементоорганического синтеза.

Производили статистическую обработку материала с подсчетом средних значений (М), их среднеквадратичных ошибок (m) и уровня достоверности (р).

В результате проведенных исследований было оценено антибактериальное действие наночастиц никеля различной концентрации на клинические штаммы Ps. aeruginosa, при различном времени воздействия. При культивировании микроорганизмов на твердых питательных средах были зафиксированы различия в количестве выросших колоний в опыте по сравнению с контролем. Результаты исследований представлены в табл. 1.

Примечание: ^***p < 0,001 по отношению к контрольной группе.

Как видно из табл. 1, количество микроорганизмов, выросших на твердой питательной среде после воздействия ультрадисперсного порошка, во всех вариантах опыта ниже, чем в контроле. В результате исследований было установлено, что действие наночастиц в концентрации 0,01 мг/мл при временной экспозиции 30 и 60 минут не приводило к статистически достоверному изменению количества колоний на твердой питательной среде. Количество выживших микроорганизмов здесь составило 95,3 и 98,9 % соответственно. Увеличение времени инкубации до 60 и 120 минут приводило к снижению количества жизнеспособных микроорганизмов до 66 и 61,1 % соответственно (при p < 0,001).

При повышении концентрации нанопорошка до 0,05 мг/мл отмечалось усиление его антибактериальной активности при экспозициях 30, 60, 120 минут. Количество выживших микроорганизмов здесь составило 66, 55,5 и 53,8 % соответственно (при p < 0,001). Кроме того, статистически достоверно было отмечено незначительное снижение бактерицидной активности металла в концентрации 0,05 мг/мл и инкубации в течение 90 минут, по сравнению с экспозицией 60 минут на 6,6 %.

Воздействие наночастиц никеля в концентрации 0,1 мг/мл при экспозиции 30 и 60 минут приводило к незначительному снижению количества жизнеспособных микроорганизмов по 16,3 -16,1%  (сравнению с контрольной группой на 16,3 и 16,1 % соответственно (при p < 0,001). Однако этот показатель оказался ниже, чем при концентрации 0,05 мг/мл на 17,7 % при экспозиции в течение 30 минут и 28,4 % - 60 минут.

Концентрация 0,5 мг/мл при временной экспозиции 30, 60, 90 минут способствовала снижению количества бактериальных клеток до 37,2, 1,2, и 1,1 % соответственно. Инкубация в течение 120 минут приводила к полному отсутствию роста микроорганизмов на твердых питательных средах.

Концентрация 1 мг/мл при воздействии 30 и 60 минут вызывала практически полную гибель бактерий, количество выживших микроорганизмов здесь составило 2,4 и 0,7 % соответственно (при p < 0,001). Дальнейшее увеличение времени инкубации при данной концентрации приводило к полной гибели микроорганизмов.

Таким образом, в результате проведенных исследований была установлена зависимость антибактериального эффекта наночастиц никеля в отношении штаммов Ps. aeruginosa от концентрации (рис. 1) и времени воздействия (рис. 2).

Ранее проведенные исследования объясняют бактерицидное действие наночастиц никеля значительными изменениями и повреждениями мембранных структур микробной клетки. Кроме того, часть частиц способна проникать внутрь клетки и вступать во взаимодействие с фосфор- и серосодержащими соединениями, такими как ДНК, что приводит, возможно, к потере способности ДНК к репликации. Кроме того, наночастицы никеля могут связываться с функциональными группами белков, приводя их к денатурации или дезактивации.

В результате проведенных исследований было изучено изменение биохимической активности клинических штаммов Ps. aeruginosa после воздействия наночастиц никеля. Результаты исследований представлены в табл. 2.

В ходе эксперимента установлено, что все исследуемые штаммы синегнойной палочки в контроле обладали низкой сахаролитической активностью. Изучаемые микроорганизмы были способны окислять глюкозу, ксилозу, а также давали положительную реакцию в тесте с цитратом. Кроме того, 40 % исследуемых штаммов были способны использовать маннит, 55 % - галактозу, 15 % - трегалозу.

При изучении биохимических свойств клинических штаммов Ps. aeruginosa, после воздействия наночастиц выявлено незначительное увеличение сахаролитической активности. Так, 85 % штаммов стали давать положительную реакцию с галактозой, 30 % - с фруктозой, инозитолом и целлобиозой, 25 % - с сахарозой и лактозой, 20 % - с мальтозой и трегалозой, а также в 5 % случаев в отношении к ферментам β-галактозидаза и β-глюкозидаза. Кроме того, было зафиксировано незначительное снижение активности в отношении таких углеводов, как маннитол и цитрат (на 10 % по отношению к контролю).

Также изучена протеолитическая активность исследуемых штаммов, изменений после воздействия наночастиц не обнаружено.

В результате экспериментальных исследований был выявлен выраженный антибактериальный эффект наночастиц никеля, зависящий от концентрации и времени воздействия, в отношении клинических штаммов Ps. aeruginosa. При изучении биохимических свойств клинических штаммов Ps. aeruginosa, после воздействия наночастиц выявлено незначительное увеличение сахаролитической активности. Также изучена протеолитическая активность исследуемых штаммов, изменений после воздействия наночастиц не обнаружено.

Несмотря на свою токсичность, никель обладает олигодинамическим действием. Таким образом, он оказывает бактерицидное действие в очень низких концентрациях и может быть использован в качестве антибактериального средства для широкого спектра приложений.

• Анищенко Т.Г., д.б.н., профессор, зав. кафедрой физиологии человека и животных ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» Минобрнауки РФ, г. Саратов;
• Девдариани З.Л., д.м.н., профессор, зав. лабораторией иммунодиагностики ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзопа», г. Саратов.

Работа поступила в редакцию 23.11.2011.