Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Сердечно-сосудистые заболевания на почве атеросклероза, в первую очередь, ишемическая болезнь сердца (ИБС) остаются одной из главных проблем здравоохранения индустриально развитых стран, в том числе России. Важно выделить ведущее патогенетическое звено, которое становится определяющим для фармакологической коррекции. Всемирная ассамблея ООН в 2002 году приняла программу по исследованию старения в XXI веке. Биохимические исследования с участием зрелых, средних, пожилых и старых людей признаны необходимыми для выявления факторов, маркеров риска и подходов к адекватной терапии возраст-ассоциированных заболеваний, разработки стратегии увеличения продолжительности жизни и улучшения ее качества в пожилом и старческом возрасте, поиска предикторов потенциального возраста дожития, а также для развития фундаментальных представлений о самом феномене старения.

Одной из актуальных задач является исследование особенностей стабильности и структурного состояния мембран в старших возрастных группах населения. С нарушениями липидного гомеостаза сопряжены атерогенез и высокий риск развития сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний. По мере увеличения возраста риск развития этих заболеваний нарастает. Пожилой возраст в целом характеризуется полиморбидностью; наиболее серьезными проблемами этой возрастной группы являются артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона.

Проведено клинико-лабораторное обследование 70 больных ишемической болезнью сердца (ИБС) различного возраста, проходивших лечение в отделении кардиологии Больницы скорой медицинской помощи №2 г. Ростова-на-Дону. Исследование проводили в трех возрастных группах. I группа - больные зрелого возраста(от 35 до 45 лет), II группа - больные среднего возраста(от 45 до 55 лет), III группа - пациенты пожилого и старческого возраста (от 55 до 75 лет).

Контрольную группу составили 30 практически здоровых людей соответствующего возраста (доноры). Биохимические исследования проводили в лаборатории биохимии НИИ биологии Южного федерального университета. Кровь брали утром натощак путем пункции локтевой вены. В качестве антикоагулянта использовали гепарин «Biochemie» (Австрия) 5000 МЕ/мл из расчета 0,1 мл гепарина на 10 мл крови. Для получения плазмы крови пробы центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Плазму крови отбирали и хранили при +4 °С. Осадок эритроцитов после отделения плазмы ресуспендировали в 10 мл раствора 0,15 М NaCl в трис- HCl буфере pH 7,4, затем центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. После трехкратного промывания из осадка эритроцитов готовили суспензии с равным содержанием белка (0,5 мг/мл пробы) и 1 % гемолизат.

Интенсивность свободнорадикальных процессов (СРП) оценивали по содержанию продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Содержание первичных молекулярных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК) - определяли методом УФ - спектрофотомерии при максимуме поглощения 232 нм [14]. Содержание вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) - определили спектрофотометрически по образованию окрашенного триметинового комплекса МДА с 2-тиобарбитуровой кислотой [14]. Конечные продукты ПОЛ - шиффовы основания - определяли спектрофлуориметрическим методом [15].

Стабильность мембран эритроцитов оценивали по уровню внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) и суммарной пероксидазной активности (СПА) в плазме крови [10]. Концентрацию гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом [12] с помощью стандартного набора фирмы «Эколаб» (Россия).

Структурное состояние мембран эритроцитов определяли с помощью флуоресцентного зонда пирена [2]. Микровязкость липидной фазы и зон белок-липидных контактов определяли методом латеральной диффузии зонда пирена в суспензии эритроцитов при концентрации белка 0,5 мг/мл и конечной концентрации зонда 8 мкМ.

Интенсивность флуоресценции измеряли на сперктрофлуориметре Hitachi 650-60 (Япония). Коэффициент эксимеризации пирена F_Э/F_M, равный отношению интенсивности флуоресценции эксимеров и мономеров пирена, находится в обратной зависимости от скорости латеральной диффузии зонда в липидном слое мембран. В вязкой среде степень экси­меризации пирена снижается, поэтому коэффициент эксимеризации находится в обратной зависимости от относительной микровязкости [2]. Микровязкость липидного слоя эритроцитарных мембран оценивали при длине волны возбуждения 334 нм, а микровязкость зон белок-липидных контактов при максимуме возбуждения света 282 нм, максимумы длин волн флуоресценции составляли для мономеров пирена - 393 нм, для эксимеров - 470 нм.

Эффективность переноса энергии электронного возбуждения с триптофановых остатков мембранных белков на пирен оценивали по тушению флуоресценции суспензии эритроцитов при длине волны возбуждения 282 нм и длине волны флуоресценции 330 нм в отсутствие пирена и после инкубации с зондом.

Эффективность переноса энергии определяли по выражению:

(F₀ - F) / F₀

где F₀ - интенсивность флуоресценции суспензии эритроцитов в отсутствие пирена; F - интенсивность флуоресценции суспензии эритроцитов после инкубации с пиреном (8 мкМ).

Полярность липидного бислоя и зон белок-липидных контактов мембран эритроцитов оценивали по соотношению интенсивности флуоресценции двух мономерных форм F372/F393 в тонкой структуре пирена при длинах возбуждения 334 и 282 нм соответственно [5]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Как показывает проведенное исследование, в эритроцитах больных ИБС различных возрастных групп наблюдается повышение содержания молекулярных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) (табл. 1). Уровень первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК) в эритроцитах возрастает на 64, 34 и 18 % в 1-3-й группах больных ИБС. Содержание промежуточных и конечных продуктов - малонового диальдегида (МДА) и шиффовых оснований (ШО) - увеличивается на 24-31 % во всех трех клинических группах пациентов, по сравнению с донорами соответствующего возраста. Как следует из полученных результатов, у больных ИБС наблюдается интенсификация как начальных, так и конечных стадий ПОЛ в мембранах эритроцитов с образованием разнообразных продуктов, вызывающих окислительное повреждение всех биомолекул и клеточных структур организма [3].

Наибольшим цитотоксическим потенциалом обладают продукты ПОЛ типа МДА, которые относятся к поперечносшивающим бифункциональным реагентам и способны взаимодействовать с различными аминосодержащими соединениями, приводя к нарушению их структуры и функции. Конечные продукты ПОЛ - ШО - являются трудно обмениваемыми и, накапливаясь, могут инактивировать мембранные белки-ферменты, ионные каналы, рецепторы, сигнальные G-белки, вызывать нарушение структурного состояния мембран и способствовать апоптозу или некрозу клетки.

Следует отметить, что в эритроцитах доноров с увеличением возраста повышается уровень ДК и МДА во 2-й и 3-й группах, а содержание ШО возрастает в эритроцитах только в группе пожилого и старческого возраста, по сравнению с 1-й группой. Это согласуется с исследованиями [11], свидетельствующими о повышении интенсивности свободнорадикального окисления (СРО) по мере старения. Повышение уровня ПОЛ в мембранах эритроцитов больных ИБС может быть причиной нарушения их стабильности и повышения проницаемости, а это снижает эффективность функционирования эритрона и ухудшает реологические свойства крови. В исследовании [6] показано, что липопероксидация в мембранах эритроцитов сопровождается выраженными морфологическими трансформациями клеток - везикуляцией, агрегацией, формированием эхино- и стоматоцитов, сложными изменениями структуры плазматической мембраны и гиперполяризацией.

Примечания: здесь и далее Р₁ - достоверность различий относительно здоровых (доноров), Р₂ - достоверность различий 2-й и 3-й группы доноров относительно 1-й группы доноров. Достоверность различий: * - при Р < 0,05; ** - при Р < 0,01; *** - при Р < 0,001;- ˙тенденция к изменению 0,05 < Р < 0,1; % - изменение в процентах по отношению к какому-либо из вариантов.

Важнейшая роль в поддержании стационарного уровня ПОЛ в крови принадлежит антиоксидантным ферментам эритроци- тов - супероксиддисмутазе (СОД) и каталазе, которые функционируют сопряженно и ингибируют СРО на стадии активации молекулярного кислорода и зарождения цепного процесса ПОЛ. Нами установлено, что в эритроцитах больных с коронарным синдромом отмечается снижение на 13-33 % активности ферментов первичного звена антиоксидантной защиты (рисунок), что согласуется с работами [9, 11]. Аналогичная динамика активности СОД и каталазы обнаружена нами также в эритроцитах доноров 2-й (средний возраст) и 3-й (пожилой и старческий возраст) групп, что согласуется с данными литературы [11]. Известно, что в условиях ишемии миокарда наблюдается резкое увеличение генерации активных форм кислорода и азота [11], которые могут привести к окислительной модификации СОД и каталазы. Установлено, что супероксид вызывает окислительное повреждение каталазы путем ее трансформации в прооксидантную форму, разлагающую перекись водорода по свободнорадикальному механизму с образованием гидроксильного радикала [3]. В свою очередь, перекись водорода, образующаяся при ферментативной и спонтанной дисмутации, является эффективным ингибитором СОД и сообщает ферменту прооксидантные свойства [3, 11]. Оксид азота и его реактивные интермедиаты (ONOOH, NO₂^.),которые в избытке образуются при ишемии миокарда, могут существенно снизить активность СОД и каталазы посредством образования металлонитрозильных комплексов в активном центре ферментов или нитрования аминокислотных остатков апо- ферментов[11].

Стационарность процесса ПОЛ является важнейшим условием стабильности и нормального функционирования биомембран. Установлено, что при усилении ПОЛ уменьшается содержание полиненасыщенных жирных кислот мембранных фосфолипидов и изменяются физико-химические свойства мембран: микровязкость или текучесть, мембранный потенциал, полярность внутренних областей мембраны [4, 13]. Некомпенсированная активация ПОЛ в эритроцитах больных ИБС различного возраста, показанная в данной работе, может явиться причиной нарушения стабильности и структурной организации мембран и привести к изменению их барьерной и матриксной функции [3]. Исходя из полученных данных следует, что наблюдается нарушение стабильности мембран эритроцитов больных ИБС трех возрастных групп, что подтверждается динамикой внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) и суммарной пероксидазной активности (СПА) в плазме крови, которые рассматриваются как чувствительные показатели стабильности мембран эритроцитов [10].

Полученные результаты показывают, что в плазме крови больных ИБС трех возрастных групп уровни ВЭГ и СПА повышаются на 17-50 и 27-36 % соответственно.

В возрастных группах доноров отмечено повышение на 55 % уровня СПА в плазме крови 3-й группы условно здоровых лиц, по сравнению с группой лиц зрелого возраста (см. табл. 1).Нарушение стабильности мембран эритроцитов больных ИБС различного возраста приводит к выходу ВЭГ и продуктов его деструкции в плазму крови, способствует углублению сдвигов метаболизма, вторичной активации ПОЛ и повышению ишемического повреждения миокарда. Показано, что взаимодействие ВЭГ и перекиси водорода приводит к образованию гидроксильного радикала, феррил- и перферрил-радикалов гемоглобина, которые являются активными индукторами ПОЛ [3].Важно отметить, что с увеличением уровня ВЭГ неизбежно возрастает прооксидантный потенциал плазмы. Кроме того, показано, что основной вклад в СПА плазмы вносит ВЭГ [10].

Исследование структурных свойств мембран эритроцитов с помощью флуоресцентного зонда пирена свидетельствует о снижении параметра Fэ/Fм (334) на 11-18 % в трех клинических группах больных ИБС, что указывает на соответствующее уменьшение текучести (или соответствующее повышение микровязкости) липидного бислоя мембран эритроцитов, по сравнению с нормой (табл. 3). Это может привести к повышению ригидности эритроцитарной мембраны, нарушению мембранных процессов, ухудшению микроциркуляции. В работе Браже и др., 2006 [15] также показано, что у пациентов с ИБС увеличивается вязкость поверхностных слоев плазматической мембраны эритроцитов. При этом уменьшается уровень оксигемоглобина вследствие ухудшения диффузии кислорода через мембрану и снижения насыщенности эритроцитов кислородом, что усугубляет тканевую гипоксию.

С увеличением возраста в группах доноров наблюдается тенденция к снижению текучести липидного бислоя мембран эритроцитов в 3-й группе условно здоровых лиц, по сравнению с 1-й группой. Исследованиями [8] установлено, что при старении наблюдается повышение агрегационной активности эритроцитов при снижении их деформируемости на фоне изменения липидного состава эритроцитарных мембран в сторону преобладания холестерина и снижения поверхностного заряда клеток.

Вместе с тем на фоне повышения микровязкости липидного бислоя эритроцитарных мембран наблюдается увеличение на 11-27 % параметра Fэ/Fм (282) зонда пирена в эритроцитах трех групп больных ИБС, что свидетельствует о повышении текучести зон белок-липидных контактов (или аннулярных липидов) (см. табл. 3). В контрольных группах данный параметр незначительно изменяется с возрастом.

Изменение структурной организации эритроцитарных мембран больных ИБС различного возраста проявляется также в уменьшении на 10-16 % параметра Fo-F/Fo зонда пирена, характеризующего снижение эффективности переноса энергии электронного возбуждения с триптофановых остатков мембранных белков на пирен (см. табл. 3). Такие изменения параметра Fo-F/Fo могут свидетельствовать о структурных перестройках в мембранных белках эритроцитов, связанных с уменьшением степени погружения белков в липидный бислой, олигомеризацией белковых молекул, адсорбцией на мембране компонентов пептидной природы.

В то же время в контрольных группах отмечено снижение параметров Fo-F/Fo на 6-8 % во 2-й и 3-й группах, по сравнению с 1-й группой условно здоровых лиц. Это свидетельствует о повышении уровня структурных перестроек мембранных белков эритроцитов с возрастом.

Полученные результаты показывают, что в мембранах эритроцитов больных ИБС 1-й и 2-й возрастной группы наблюдается повышение параметра F372/F393 (334), характеризующего полярность липидного бислоя (см. табл. 3). Это указывает на повышение полярности микроокружения зонда пирена, который диффундирует в области жирнокислотных остатков фосфолипидов, и появление гидрофильных кластеров в липидном бислое, что способствует его дестабилизации. С увеличением возраста в контрольных группах обнаруживается аналогичная направленность изменений, показана тенденция к повышению полярности липидного бислоя мембран эритроцитов в 3-й контрольной группе, по сравнению с 1-й группой.

Таким образом, проведенное исследование показывает, что при ишемии миокарда наблюдаются нарушения стабильности и структурной организации эритроцитарных мембран, которые в ряде случаев усиливаются с возрастом.

Нарушение структурного состояния мембран эритроцитов больных ИБС различного возраста характеризуется противоположными изменениями текучести липидного бислоя, которая снижается, и аннулярных липидов, которая увеличивается, структурными перестройками мембранных белков и повышением полярности мембран. Нарушение стабильности (по уровню СПА) и структурной организации мембран эритроцитов (по уровню структурных перестроек мембранных белков) более выражены в 3-й возрастной группе больных ИБС, по сравнению с 1-й группой пациентов. В контрольных группах с увеличением возраста также наблюдается снижение стабильности и изменение структурного состояния мембран эритроцитов, имеющие одинаковую направленность со сдвигами структурного гомеостаза, наблюдающимися при ИБС, которая относится к воз- раст-ассоциированным патологиям.

Выводы

1. В плазме крови больных ИБС разного возраста наблюдается увеличение скорости интенсивности ПОЛ, наиболее выраженное в группе пожилого и старческого возраста; отмечается компенсаторная активация антиоксидантных компонентов плазмы - ЦП и V_H2O2. В эритроцитах - выявлена интенсификация ПОЛ, усиливающаяся в старшей возрастной группе, на фоне подавления активности ферментов первичного звена антиоксидантной защиты - СОД и каталазы.
2. У больных ИБС с увеличением возраста наблюдается нарушение стабильности и структурной организации эритроцитарных мембран, характеризующееся повышением микровязкости липидного бислоя, текучести зон белок-липидных контактов (аннулярных липидов), увеличением уровня структурных перестроек мембранных белков и повышением полярности внутренних гидрофобных областей мембраны.

• Колмакова Т.С., д.б.н., зав. кафедрой медицинской биологии и генетики ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет», г. Ростов-на-Дону;
• Бондаренко Т.И., д.б.н., профессор ФГОУ ВПО «Южный федеральный университет», г. Ростов-на Дону.

Работа поступила в редакцию 08.10.2011.