Фундаментальные и прикладные исследования в области хитина и хитозана в сфере биологии и медицины показывают четкую тенденцию прочного вхождения этих биополимеров и их химических дериватов не только в качестве эффективной биодобавки к пищевым продуктам, но и в качестве самостоятельных конструкций, способных выполнять конкретные задачи в профилактике и лечении заболеваний терапевтического и хирургического плана. Известная пищевая добавка благодаря всемирным достижениям в научном поиске переходит в разряд парентеральных имплантатов, выполняя функции систем переноса целевых молекул или клеток через агрессивные среды без потери их изначальной активности. Традиционно считалось, что возможность регенерации спинного мозга (СМ) резко ограничена в связи с необратимыми морфологическими изменениями в нервной ткани после повреждения. Однако за последнее время накоплены экспериментальные результаты и ограниченный клинический материал, свидетельствующие о принципиальной возможности регенерации в центральной нервной системе (ЦНС) и возможном восстановлении ее нарушенных функций [8, 16, 18]. Полученные научные факты позволяют с современных позиций пересмотреть канонизированные представления о регенераторном потенциале в ЦНС, а также предложить новые стратегии и концепции лечения повреждений СМ [1, 2, 3, 12]. Большинство исследователей в этой области полагают, что будущее принадлежит технологиям регенераторной медицины. Основным инструментом регенераторной медицины являются различные клеточные технологии от трансплантации клеток (клеточная терапия) до тканевой инженерии. В этом смысле речь идет о введении клеток при травматическом повреждении спинного мозга (СМ). Нейрональные клетки-предшественники можно получить при определенном микроокружении в условиях in vitro из ЭСК и в дальнейшем использовать в качестве собственно клеточного трансплантата. Подобные манипуляции приводят к положительной неврологической динамике и морфологическому восстановлению СМ. При этом эффект трансляции жизнеспособного пересаженного клеточного материала существен и сопровождается дифференцировкой на 3 основных типа нейрональных клеток: нейроны, астроциты и олигодендроциты [17]. Маркерный анализ подтверждает процесс ремиелинизации нервных проводников [14]. Инъекция взвеси НСК, выделенных из фетального гиппокампа, приводит к достоверной их трансляции в зоне травмы СМ, дифференцировке в нейроны, астроциты и олигодендроциты и восстановлению нарушенных функций у половозрелых крыс [5] или у представителей приматов [7]. Трехмерную матрицу в качестве трансплантата, содержащего ольфакторные нейрональные клетки (ОНК), ряд авторов помещал в зону одностороннего повреждения пирамидного тракта у взрослых крыс. Результаты указывали на дифференцировку клеточной массы в Шванновские клетки и их активизацию взаимодействия с нейрофибробластами. Как известно, такая межклеточная связь провоцирует процесс миелинизации аксонов, появление новых аксонов, их рост и спрутинг в дистальную культю СМ [6, 10, 13, 15]. При этом морфологический инжиниринг СМ сопровождается сокращением неврологического дефицита, несмотря на использование модели полного пересечения СМ [11]. Совершенно очевидно, что процесс инжиниринга поддерживается комплексом молекулярного микроокружения, создаваемого клетками СМ, в основе которого лежит взаимодействие нейротрофических факторов [9].
Цель исследования - неврологический контроль у взрослых крыс с частичным разрывом спинного мозга после трансплантации коллаген-хитозановой матрицы с нейрональным микроокружением и предшественниками нейрональных клеток.
Материалы и методы исследования
Экспериментальная спинальная травма у крыс (разрыв спинного мозга). В исследования включены 24 половозрелые крысы-самки массой 200-220 г. Группу опыта в срок 1 неделя после травмы составили 19 животных, группу контроля - 5 животных, в срок 2 недели - 17 и 5 особей соответственно, в срок 3 недели - 5 и 14 особей соответственно, в срок 4 недели - 8 и 2 особи сответственно. Премедикация: за 30 мин до операции - Sol. Tramadoli 2,5 мг в/м; Sol. Atropini sulfatis 0,1 % - 0,1 мл в/м; Sol. Dimedroli 0,1 % - 0,1 мл в/м. Анестезия: наркоз (диэтиловый эфир). Животным с использованием операционного микроскопа воспроизводилась модель спинальной травмы на уровне IX-X грудных позвонков с 50 % по объему боковым пересечением ствола спинного мозга после предварительно выполненной ламинэктомии.
Ход операции. После предварительной обработки операционного поля 70-м % раствором этилового спирта под наркозом производился разрез по средней линии спины животного на уровне от Th7 до L4 длиной 4-5 см. Гемостаз производился по ходу операции. После рассечения кожи, подкожно-жирового слоя края раны мобилизовались и разводились ранорасширителями Эдсона. Остисто-трапециевидная и широчайшая мышцы отсекались от мест их прикрепления к остистым отросткам Th9 - L3. Мышцы глубокого слоя отсепаровывались от позвоночника тупым инструментом и разводились микрохирургическим ранорасширителем, оголялись дужки позвонков Th9-Th12. Производилась резекция дужки Th10, твердая мозговая оболочка рассекалась и разводилась в стороны в горизонтальной плоскости. При помощи микроскальпеля и микроножниц осуществлялось пересечение 1/2 правой боковой порции спинного мозга в поперечном направлении. В образовавшийся дефект нервной ткани размерами около 1 мм помещался нейрональный клеточно-матричный имплантат указанного ниже состава. Костная рана закрывалась полисахаридной гидрогелевой массой «Бол-хит», не содержащей животного коллагена. Рана ушивалась послойно: на глубокий слой мышц накладывались П-образные швы шовным материалом Vicril 4-0; мышцы поверхностного слоя ушивались непрерывным обвивным швом нитью Vicril 4-0; на кожу накладывались П-образные швы нитью Polyester 3-0. Швы обрабатывались спиртовым раствором йода.
Состав трансплантируемых матриц. В качестве вариантов коллаген-хитозановых конструкций готовили 2 различные подложки, содержащие следующее микроокружение для нейрональных клеток:
- лиофилизированная коллаген-хитозановая матрица, содержащая сульфатированные и несульфатированные гликозаминогликаны (хондроитинсульфат, гиалуронат натрия, гепарин), с включенными в нее элементами полной питательной среды DMEM, кондиционированной среды от нейрональных клеток мыши и нейрональной добавки N2 (контроль);
- лиофилизированная коллаген-хитозановая матрица того же состава, содержащая предшественников нейрональных клеток, полученных при культивировании и дифференцировке эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши (опыт).
Варианты пористых матриц-подложек предварительно перед посадкой на них эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) нарезали объемом 1 мм3 и в стерильных условиях раскладывали по лункам 96 луночного планшета без покрытия 0,1 % раствором желатина. Клетки с культуральных флаконов снимали 0,5-м% раствором коллагеназы, затем трижды отмывали чистой средой от фермента и переносили в лунки с нарезанной матрицой в среде для ЭСК. Клетки культивировали не менее 3-х суток до появления нейрональных маркеров в гумидных условиях при 37 °С и 6 % СО2. Количество прикрепленных клеток оценивали путем диспергирования 5-6 кусочков матрицы в растворе фермента с последующим подсчетом клеток в камере Горяева. Каждый будущий нейроимплантат в процессе культивирования содержал порядка 50 тыс. эмбриональных стволовых клеток. Перед имплантацией кусочки глазным пинцетом осторожно переносили в микропробирки с питательной средой DMEM/F12 и транспортировали в операционную.
Послеоперационный уход. В течение 3-5 дней после операции в качестве анальгетика животные получали Sol. Tramadoli 2,5 мг 3 раза в день в/м. Швы снимали на 10 сутки. В ранний послеоперационный период, в первые 24 часа - допуск животных к воде. Кормление - на 2-3 сутки после операции исключительно смесью «Полипротен-нефро» (лечебное питание) в течение 1-4 недель. Крысы содержались в раздельных клетках с двойным сетчатым дном для активного передвижения, соблюдения гигиены, самостоятельного приема воды и пищи. Лекарственную поддержку осуществляли антибиотиком широкого спектра действия, спазмолитиками, сосудорасширяющими препаратами.
Динамический неврологический контроль. Для оценки неврологических нарушений и динамики восстановления применялась шкала оценки выраженности неврологического дефицита (Neurological Severity Scores - NSS)[4] в течение 1-4 недель послеоперационного периода. В схему контроля входили:
- Оценка моторной функции (подвешивание крысы за хвост с регистрацией сгибания передней и задней конечностей, отклонения головы более чем на 10 градусов от вертикальной оси в течение 30 с, помещение крысы на пол с оценкой нормального движения по полу, неспособности сохранять направленное движение, движения по кругу в сторону паретичных конечностей, падения на паретичную сторону.
- Оценка сенсорной функции (укладывание: зрительный и тактильный тесты; проприоцептивный тест (придавливание лапки к краю стола).
- Оценка равновесия (сохранение равновесия и стабильное положение тела, захватывание балансира, крепкое сжатие балансира и отвисание одной паретичной конечности вдоль балансира, крепкое сжатие балансира и отвисание двух паретичных конечностей вдоль балансира, или кружение на балансире (более 60 с), попытка сохранить равновесие на балансире (более 40 с), но падение с него, попытка сохранить равновесие на балансире (более 40 с), но падение с него, падение без попытки балансировать или ухватиться за балансир (менее 20 с).
- Отсутствие рефлексов или патологическая двигательная активность (рефлекс с ушной раковины при дотрагивании до слухового бугорка - тряска головой, роговичный рефлекс при дотрагивании до роговицы кусочком ваты - мигание, рефлекс испуга (двигательный ответ на короткий шум при щелкании зажима для бумаги), судороги, миоклонус, миодистония. Один балл соответствует невозможности выполнять задание или отсутствие тестируемого рефлекса; 13-18 баллов - выраженное повреждение; 7-12 баллов - повреждение средней степени тяжести; 1-6 баллов - умеренное повреждение.
Результаты исследования и их обсуждение
Спинальная травма. Моделирование спинальной травмы на уровне IX-X грудных позвонков с частичным (50 % по объему) боковым пересечением ствола спинного мозга и имплантацией в диастаз между центральным и периферическим сегментами спинного мозга коллаген-хитозановой матрицы с эмбриональной нейрональной клеточной массой показало адекватность используемой модели. У животных в послеоперационном периоде без лечения в течение 4-х недель имелось стойкое выпадение определенных сенсорных и моторных зон иннервации в области нижних конечностей, таза, нижней половины туловища. Использованная модель позволяет технически осуществлять имплантацию коллаген-хитозановых матриц в область разрыва спинного мозга, создает возможность надежно выхаживать животных в послеоперационном периоде с нулевой смертностью.
Анализ неврологических нарушений после моделирования спинальной травмы и имплантации в диастаз спинного мозга контрольных и опытных матриц показал положительную динамику сенсорного и моторного восстановления спинного мозга.
Тест «суживающаяся дорожка» заключался в прохождении крысой по дорожке длиной 165 см и шириной в начале пути - 9 см, в конце пути - 3 см. Дорожка располагается на высоте 120-130 см над полом, что создаёт у крыс мотивацию для её преодоления. Крысы с повреждением спинного мозга при продвижении вперёд начинали оступаться (наступать тазовыми конечностями мимо дорожки). В зависимости от степени тяжести травмы спинного мозга в целом, и степени нарушения проприорецепции в частности, крысы могли безошибочно проходить по дорожке различное расстояние. Интактные крысы преодолевали дорожку полностью.
Результаты анализа показали, что в присутствии как только матрицы с полным микроокружением, так и матрицы с эмбриональной клеточной массой - предшественниками нейрональных клеток происходит существенное улучшение неврологических показателей, таких как моторная и сенсорная активность задних конечностей, отсутствие патологической двигательной активности, восстановление состояния равновесия, улучшение выполнения тестов на горизонтальной поверхности и передвижений по суживающей дорожке. Через 1 неделю после частичной транссекции спинного мозга интегральная сумма балла в контроле, включающая оценку моторной, сенсорной активности, равновесия, патологическую двигательную активность составила 8,8 баллов, в опыте - 8,94 баллов, что соответствует средней степени тяжести спинальной травмы. Животные в тесте «беговая суживающая дорожка» проходили за лимитное время в среднем 13,8 см. Через 2 недели после нанесения спинальной травмы интегральная сумма баллов при оценке неврологических функций экспериментального животного составила в контроле 6,2, в опыте - 7,46, что указывает на снижение тяжести нарушений и приближение ее к границе умеренного повреждения. Через 3 недели после экспериментальной травмы спинного мозга интегральная сумма нарушений в контроле составила 5,4 балла, а в опыте 6,12 балла. Эти величины соответствуют умеренной силе повреждения. Динамика снижения тяжести неврологических нарушений сохраняется к 4-й неделе послеоперационного периода и составляет в опыте 5,6 балла. При этом в тесте «беговая суживающая дорожка» крысы опытной группы наращивали каждую неделю расстояние пробега от 13,8 см в 1-ю неделю до 47,5 см в 4-ю неделю. Необходимо указать, что положительный эффект при имплантации матрицы без клеток при отсутствии воспалительных процессов связан скорее всего с достаточным набором факторов, включенных в ее состав, необходимых для стимуляции миграции собственных клеток, участвующих в регенерации. Другими словами, сама матрица регулирует репарационные процессы в ране.
Заключение
Таким образом, исследования неврологического статуса у взрослых крыс после экспериментального частичного пересечения спинного мозга и прямой трансплантации коллаген-хитозановой губки, содержащей нейрональное микроокружение, и предшественников нейрональных клеток мыши, подтверждают положительную неврологическую динамику в тестах Neurological Severity Scores - NSS в течение 1-4 недель после операции. Положительное действие имеет место не только при трансплантации предшественников нейрональных клеток, но и при трансплантации безклеточной подложки, содержащей нейрональное микроокружение.
Исследования выполнены при поддержке гранта ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» МЗ СР РФ (2009), грантов государственного фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (проект №6746р/9167 от 10.04.2009 г. и проект № 8775 р/13993 от 11.01.2011 г.).
Рецензенты:
- Прокопенко С.В., д.м.н., профессор, научный руководитель Центра нейрореабилитации ФГБУ «Сибирский Клинический Центр Федерального медико-биологического агентства», г. Красноярск;
- Зайцева О.И., д.м.н., зав. лабораторией клинической мембранологии и иммунохимических исследований НИИ Медицинских проблем Севера СО РАМН, г. Красноярск.
Работа поступила в редакцию 25.10.2011.