Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Цель терапии хронического миелолейкоза (ХМЛ) на современном этапе - достижение цитогенетических и молекулярных ремиссий. Это стало возможным с внедрением в клиническую практику ингибиторов тирозинкиназ. С момента применения гливека для лечения ХМЛ прошло уже более 10 лет, за это время глобально изменилось отношение к проблеме хронического миелолейкоза в целом [2, 8]. В настоящее время важен не только факт достижения одной из конечных точек лечения - полного цитогенетического ответа (ПЦО), но и срок, к которому достигается этот ответ [4, 9]. Получение полного цитогенетического и большого молекулярного (БМО) ответов к 12 месяцам терапии гарантирует 100 %-ю безрецидивную выживаемость [10].

Такого результата удается достичь не у всех больных. В основе развития резистентности к гливеку лежат несколько механизмов, которые подразделяют на BCR-ABL-зависимые и BCR-ABL-независимые. К BCR-ABL-зависимым механизмам относят мутации и амплификацию гена BCR-ABL. BCR-ABL-независимые механизмы включают в себя «клональную эволюцию» (появление дополнительных хромосомных аберраций в Ph-позитивных лейкозных клетках), активацию BCR-ABL-независимых путей, например, членов семейства Src-киназ, избыточное связывание иматинибна с сывороточным а-1-кислым гликопротеином, дисбаланс между клеточными белками-переносчиками препарата [3, 7].

Первичная резистентность (или рефрактерность) определяется как отсутствие полного цитогенетического через 12 месяцев, большого молекулярного ответа - через 18 месяцев терапии. Вторичная, или приобретенная, резистентность - это потеря гематологического, цитогенетического или молекулярного ответов, либо прогрессия заболевания до фазы акселерации или бластного криза [2, 8]. Увеличение дозы гливека до 600-800 мг/день позволяет преодолеть резистентность и улучшить результаты терапии у 25-40 % больных в хронической фазе ХМЛ [5]. Изучение механизмов резистентности к гливеку и путей ее преодоления является чрезвычайно актуальным.

В этой связи мы изучили концентрацию каспазы 9, отражающую проявление одного из ведущих эффектов химерного гена BCR-ABL. К настоящему времени хорошо известна функция индуктора апоптоза каспазы 9, которая относится к классу инициирующих каспаз [1, 6]. Однако роль каспазы 9 при гемобластозах и, в частности ХМЛ, практически не изучалась. Определение концентрации каспазы 9 принципиально значимо для уточнения одного из важнейших звеньев патогенеза ХМЛ - угнетения апоптоза.

Цель исследования: изучить концентрацию инициатора апоптоза каспазы 9 в сыворотке крови у больных хроническим миелолейкозом, получающих лечение гливеком.

Материалы и методы исследования

Исследование проспективное, продольное. Работа выполнена на основе собственных наблюдений в период с 2006 по 2011 г. В исследование включено 53 больных ХМЛ. Возраст больных колебался от 23 до 78 лет. Средний возраст больных составлял 52,1 ± 1,72 лет. Длительность лечения гливеком варьировалась от года до 5 лет. Продолжительность заболевания до начала терапии гливеком была от 0 до 87 месяцев. Диагноз, распределение по фазам заболевания и характер ответа на лечение определялись согласно критериям Европейского общества по изучению хронического миелолейкоза European Leukemia Net (ELN-2009) [9].

Критерии включения больных в исследование: хроническая фаза хронического миелолейкоза, терапия гливеком в течение 24 и более месяцев. Критерии исключения из исследования: пациенты, не получающие гливек; пациенты, получающие гливек менее 24 месяцев; пациенты в стадии акселерации и бластного криза; пациенты с сопутствующей патологией, при которой может повышаться концентрация маркера апоптоза каспазы 9.

Статистическая обработка данных проводилась при помощи статистической программы STATISTIСA 7. Для каждого показателя и групп наблюдения вычисляли среднее значение, ошибку средней арифметической. Учитывая небольшой объем наблюдений, при статистических расчетах использовались формулы для малых групп. Был использован непараметрический метод статистической обработ-
ки - критерий Манна-Уитни. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.

В процессе работы проводились молекулярно-генетические исследования крови методом ПЦР в реальном времени - количественная оценка экспрессии химерного гена BCR-ABL типа р210; исследования костного мозга: цитологические (миелограмма), цитохимические, цитогенетические - определение транслокации t (9; 22) (q34; q11), молекулярно-цитогенетические - флуоресцентная in situ гибридизация хромосом (FISH) с ДНК зондом к слитному гену BCR-ABL.

Количественное определение каспазы 9 в сыворотке крови проводилось иммуноферментным методом. Были использованы тест-системы фирмы Bender MedSystems (Австрия). Чувствительность тест-системы для определения концентрации каспазы 9 менее 0,4 ng/ml.

В контрольную группу были включены 30 здоровых доноров, жителей Астраханской области. По половому признаку и возрасту группа сопоставима с исследуемой группой больных ХМЛ. Полученные в ходе исследования результаты варьировались в диапазоне - от 0,97 до 4,17 нг/мл. Среднее значение данного показателя составило - 2,03 ± 0,68 нг/мл. Таким образом, полученные нами показатели уровня каспазы 9 в группе здоровых доноров оказались сопоставимыми с приведенными данными сопроводительной аннотации к набору реагентов. Это дало нам основание использовать полученные значения в дальнейшем в качестве контроля в проводимом исследовании.

Результаты исследования и их обсуждение

Первичная точка обследования в нашей работе - 18 месяцев терапии гливеком взята в связи с планом комплексной научной работы нашей кафедры: «Современные аспекты диагностики, мониторинга лечения и прогноза у больных хроническим миелолейкозом в отдельных популяциях Южного Федерального округа», частью которой является данное исследование. Кроме того, согласно критериям ELN-2009 г., это тот срок, когда проводится окончательная клиническая оценка ответа на терапию гливеком и именно к этому времени больной с оптимальным ответом на терапию гливеком должен достичь большого молекулярного ответа.

Полученные нами в ходе исследования значения концентрации каспазы 9 в сыворотке крови у 53 обследованных больных ХМЛ варьировались в диапазоне - от 0,84 до 15,84 нг/мл. Нами определена концентрация каспазы 9 на каждую контрольную точку лечения больных ХМЛ - 18, 24, 30, 36 месяцев терапии гливеком.

При проведении статистической обработки мы объединили группу больных с неудачей терапии с группой субоптимального ответа. Основанием для объединения групп послужило то, что при субоптимальном ответе (как и при неудаче терапии) ведущий критерий - большой молекулярный ответ в срок 18 месяцев не достигается. На данном этапе работы мы сравнили концентрацию каспазы 9 на 18 месяцев терапии гливеком у больных с оптимальным ответом и с неудачей терапии (табл. 1).

Как представлено в табл. 1, концентрация каспазы 9 у больных с оптимальным ответом составила 2,09 ± 0,03 нг/мл, у больных с неудачей терапии 3,21 ± 0,07 нг/мл, т.е. отмечено значительное повышение концентрации каспазы 9 в группе неудачи терапии. Данные статистически значимы по сравнению со значениями в контрольной группе и группе оптимального ответа (p < 0,05). Полученные данные говорят об активации процессов апоптоза. В группе с оптимальным ответом достоверных отличий от данных в контрольной группе нет, что говорит о нормализации процессов апоптоза.

Таблица 1

Концентрация каспазы 9 у больных ХМЛ, в зависимости от ответа на лечение в срок 18 месяцев терапии гливеком

Примечания:

р - достоверность различия показателей по сравнению с контрольной группой;

р1 - достоверность различия показателей группы оптимального ответа по сравнению с группой неудачи терапии.

Далее мы провели прицельный анализ - в контрольной точке 24 месяца терапии гливеком проанализировали различия концентрации каспазы 9 в зависимости от достижения полного цитогенетического, большого молекулярного и полного молекулярного ответов(ПМО) (табл. 2).

Таблица 2

Концентрация каспазы 9 у больных ХМЛ в зависимости от цитогенетического и молекулярного ответов в срок 24 месяца лечения гливеком

Примечания:

р - достоверность различия показателей по сравнению с контрольной группой;

р1 - достоверность различия показателей группы ПЦО и нет ПЦО;

р2 - достоверность различия показателей группы ПМО и нет ПМО/БМО.

Как представлено в табл. 2, у больных ХМЛ, достигших полного цитогенетического ответа в срок 24 месяца терапии гливеком, концентрация каспазы 9 не отличается от данных контрольной группы.

В группе больных ХМЛ, не достигших полного цитогенетического ответа в срок 24 месяца терапии гливеком, концентрация каспазы 9 значительно выше контроля, что подтверждается и данными в группе отсутствия полного или большого молекулярного ответов: 2,63 ± 0,03 и 3,80 ± 0,02 нг/мл (p < 0,05) соответственно. При статистическом анализе показаны достоверные различия концентрации каспазы 9 между группами ПЦО и нет ПЦО также, как и между группами ПМО и нет ПМО/БМО (p1 < 0,05; p2 < 0,05).

В задачи нашего исследования входило проанализировать колебания концентрации каспазы 9 в сыворотке крови больных ХМЛ на поздних сроках лечения гливеком. В связи с этим мы изучили концентрацию каспазы 9 через 30 месяцев лечения у больных ХМЛ в зависимости от достижения цитогенетического и молекулярного ответов (табл. 3).

Таблица 3

Концентрация каспазы 9 у больных ХМЛ, в зависимости от цитогенетического и молекулярного ответов, в срок 30 месяцев лечения гливеком

Примечания:

р - достоверность различия показателей по сравнению с контрольной группой;

р1 - достоверность различия показателей группы ПЦО и нет ПЦО;

р2 - достоверность различия показателей группы ПМО и нет ПМО/БМО.

Как представлено в табл. 3, у больных, достигших полного цитогенетического ответа, концентрация каспазы 9 составила 2,92 ± 0,06 нг/мл, что статистически значимо по сравнению с контрольной группой. В группе больных с отсутствием цитогенетического ответа концентрация каспазы 9 не превышает значения концентрации в контрольной группе и составляет 2,02 ± 0,02. Различия между группами ПЦО и нет ПЦО достоверны (p < 0,05).

При анализе молекулярного ответа имеются сопоставимые результаты: у больных, достигших большого или полного молекулярного ответа, концентрация каспазы 9 составила 2,62 ± 0,02 нг/мл, что достоверно отличается от контроля. У больных, не достигших большого или полного молекулярного ответа, концентрация каспазы 9 - 2,09 ± 0,04 нг/мл, что достоверно не выше значений в контрольной группе. Различия между группами ПМО и нет ПМО/БМО достоверны (p < 0,05).

Уменьшение концентрации каспазы 9 у больных, не достигших полного цитогенетического и большого молекулярного ответов, по нашему мнению, говорит о том, что терапия гливеком в данном случае, недостаточна для сдерживания патологического клона, который подавляет естественный и индуцированный гливеком механизм апоптоза.

Следующим этапом работы было изучить концентрацию каспазы 9 в конечной точке нашего исследования - 36 месяцев терапии гливеком. Полученные данные представлены в табл. 4.

Таблица 4

Концентрация каспазы 9 у больных ХМЛ, в зависимости от цитогенетического и молекулярного ответов, в срок 36 месяцев лечения гливеком

Примечания:

р - достоверность различия показателей по сравнению с контрольной группой;

р1 - достоверность различия показателей группы ПЦО и нет ПЦО;

р2 - достоверность различия показателей группы ПМО и нет ПМО/БМО.

Из данной таблицы следует, что у больных, достигших полного цитогенетического ответа на 36 месяцев терапии гливеком, концентрация каспазы 9 составила 4,04 ± 0,1 нг/мл, что статистически значимо по сравнению с контрольной группой. В группе больных с отсутствием цитогенетического ответа концентрация каспазы 9 не превышает значения концентрации в контрольной группе и составляет 2,41 ± 0,03 нг/мл. Такие же уровни концентрации каспазы 9 мы видим при анализе молекулярного ответа. У больных, достигших большого или полного молекулярного ответов, концентрация каспазы 9 составила 4,04 ± 0 нг/мл, что достоверно отличается от контроля. У больных, не достигших большого или полного молекулярного ответов, концентрация каспазы 9 - 2,41 ± 0,03 нг/мл, что не отличается от значений в контрольной группе. Здесь мы видим достоверное увеличение концентрации каспазы 9 у больных с ПЦО и ПМО/БМО по сравнению с группами больных, не достигших этих ответов (p1 < 0,05; p2 < 0,05).

Проведя анализ полученных данных, можно сделать следующий вывод: концентрация каспазы 9 у больных ХМЛ в контрольной точке - 24 месяца терапии выше в группе больных, у которых отсутствовал ответ на лечение гливеком. На 30 и 36 месяцев концентрация каспазы 9 меняется противоположным образом: выше в группе с полным цитогенетическим и молекулярным ответом.

Как показали результаты нашего исследования, определить концентрацию маркеров апоптоза (в данном случае каспазы 9) в одной контрольной точке лечения и сделать на основании этого окончательное заключение невозможно.

Своим исследованием мы показали, что концентрация ведущего инициатора каспазозависимого пути апоптоза - каспазы 9, колеблется на различных этапах лечения в зависимости от степени эффективности гливека.

В конечной точке нашего исследования - 36 месяцев терапии гливеком, полученные данные укладываются в определенную логическую цепочку: у больных с полным цитогенетическим ответом концентрация каспазы 9 удерживается на уровне нормальных показателей или несколько выше нормы, что говорит о результативности действия гливека и эффективности процессов апоптоза.

У больных, не достигших полного цитогенетического ответа к сроку 36 месяцев лечения, гливек не сдерживает массы опухоли, процессы апоптоза подавлены, заболевание прогрессирует. И хотя у данной группы больных сохраняются нормальные показатели крови и объективные данные - в любой момент зыбкая система равновесия «апотоз-опухоль» может рухнуть и гливек полностью потеряет контроль над опухолевым клоном, заболевание начнет прогрессировать до фазы акселерации и бластного криза.

Заключение

Концентрация каспазы 9 в сыворотке крови больных ХМЛ отражает патогенез заболевания. Снижение концентрации каспазы 9 на поздних сроках лечения (более 3 лет) у больных ХМЛ, не реагирующих на терапию гливеком, указывает на снижение процессов апоптоза и подавление нормального поликлонального кроветворения более сильной системой - системой опухолевых (лейкозных) клеток. Полученные нами данные подтверждаются клиническими проявлениями и могут использоваться в прогнозировании исходов хронического миелолейкоза.

Рецензенты:

Ларина Н.Н., д.м.н., зам главного врача по медицинской части ГУЗ «Александро-Мариинская областная клиническая больница», г. Астрахань;

Эсаулова Т.А., д.м.н., профессор, зав. терапевтической службой Негосударственного учреждения здравоохранения «Медико-санитарная часть», г. Астрахань.

Работа поступила в редакцию 23.11.2011.