Состояние гомеостаза, характеризующееся увеличением содержания свободнорадикальных молекул, получило название «оксидативный стресс» [9]. Причиной его может быть увеличение продукции свободных радикаe-mailлов и (или) снижение эффективности антиоксидантных систем. Оксидативный стресс может быть локальным и генерализованным, умеренным (когда модифицируются и разрушаются отдельные молекулы) и сильным (приводит к гибели клеток и групп клеток) [6]. Основной повреждающий эффект свободных радикалов заключается в разрушении мембран клеток, модификации белков и ДНК [7]. Полагают, что использование лазерного излучения с высокой импульсной мощностью увеличит глубину проникновения. При этом поражения клетки будут везде, где присутствует растворенный кислород: в ядре, митохондриях, активируя апоптотин и вызывая повреждение ДНК [4]. Использование лазеров в клинике основывается на таких биологических эффектах, как фотодеструктивное действие света, используемое, в частности, в лазерной хирургии, и фотохимическое действие света, лежащее в основе его терапевтического использования.
Фемтосекундный волоконный эрбиевый лазер является совместной уникальной разработкой Научного центра волоконной оптики РАН и Ульяновского государственного университета. Основными преимуществами данного типа лазеров является малая длительность импульса, высокая пиковая (кВт) и малая средняя (мВт) мощности, что позволяет предполагать отсутствие выраженных термических эффектов. В медицине эти лазеры используются в качестве голографического пинцета и оптического скальпеля.
Использование ФСЛИ в терапии поверхностно локализованных опухолей позволило бы существенно снизить лучевую нагрузку на пациента.
В соответствии с вышеизложенным целью исследования было изучение влияния ФСЛИ на показатели оксидативного стресса в опухолевой ткани при экспериментальном раке шейки матки (РШМ).
Материал и методы исследования
В эксперименте на белых беспородных мышах с перевиваемой опухолью рака шейки матки (РШМ-5), банк опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.Н. Блохина) оценивали влияние ФСЛИ различной интенсивности на неоплазму in vivo. Был использован фемтосекундный импульсный волоконный эрбиевый лазер с характеристиками: длительность импульса - 100·10-15 c; промежуток между импульсами -
200-250·10-15 c; средняя мощность - 1,25 мВт; пиковая мощность - 6 кВт, длина волны - 1,55 мкм, частота 50 МГц. Плотность энергии на биоткань (Э), Дж/см2, рассчитывали по формуле:
Э = W/S,
где W - выходная энергия излучения, Дж; S - площадь лазерного пятна на биоткани, см2.
Выходную энергию для импульсно-периодического режима определяли из соотношения:
W = P(tu/tu + tn)·t,
где Р - выходная мощность излучения, Вт; t - время воздействия, с; tu - длительность импульса, с; tn - длительность паузы, с.
При режиме излучения на расстоянии 10 см (площадь воздействия 3,14 см2) средняя плотность энергии на ткань (энергетическая доза) за одну процедуру составляла 0,24 Дж/см2 за 10 минут и 0,36 Дж/см2 за 15 минут, но при этом облучение проходило в импульсном режиме при огромной пиковой интенсивности, равной 1910,8 Вт/см2 в момент импульса, и средней интенсивности - 0,0004 Вт/см2. Процедуры проводились ежедневно, при 10 процедурах 10-минутного лазерного облучения суммарная энергетическая доза лазерного излучения за курс составила 2,4 Дж/см2. При 10-кратном облучении в режиме 15 минут на расстоянии 10 см суммарная плотность энергии на ткань составила 3,6 Дж/см2.
Для оценки показателей оксидативного стресса в опухолевой ткани определяли уровень малонового диальдегида (МДА) (мкмоль/л/мг), активность супероксиддисмутазы (СОД) (у.е./мг), каталазы (ммоль/с/мг), глутатионредуктазы (ГР) (ммоль/мин/мг) и глутатионтрансферазы (ГТ) (ммоль/мин/мг).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программ Microsoft Excel 2003 и Stata 6.0.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате проведенных исследований установлено, что уровень МДА в неоплазме изменяется под влиянием ФСЛИ (табл. 1).
Таблица 1
Уровень МДА (мкмоль/мг) в неоплазме экспериментального РШМ
при воздействии ФСЛИ
|
Доза Эксп. ФСЛИ группа |
Без облучения n = 12 |
Эсред = 2,4 Дж/см2 n = 12 |
Эсред = 3,6 Дж/см2 n = 12 |
|
20-е сутки РШМ-5 |
27,94 ± 1,600 |
32,17 ± 1,150* |
33,92 ± 2,780* |
|
30-е сутки РШМ-5 |
36,30 ± 1,220 |
32,44 ± 0,960* |
33,81 ± 1,490 |
Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных без облучения, p < 0,05.
Как следует из данных табл. 1, уровень МДА возрастает в динамике опухолевой прогрессии, что не противоречит данным литературы об усилении перекисного окисления липидов при прогрессировании неоплазмы [1]. В то же время существует мнение, согласно которому активность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в опухолевых клетках снижена, что связано с изменением липидного состава клеточных мембран в сторону преобладания насыщенных жирных кислот [2].
Концентрация свободных радикалов в тканях организма находится под контролем антиоксидантных систем (АОС). Ферментативное звено АОС представлено, в частности, СОД, которая трансформирует супероксиданион в пероксид водорода и кислород, каталазой, которая может участвовать в превращении пероксида водорода в воду и кислород, глутатионпероксидазой (ГП), которая участвует в инактивации пероксида водорода и пероксиднитрита.
Результаты оценки активности компонентов АОС представлены в табл. 2.
Из данных, представленных в таблице, следует, что активность ряда ферментов АОС зависела от стадии развития опухоли: существенно и значимо в неоплазме на 30-е сутки роста возрастает активность СОД и ГТ. Опухолевая трансформация сопровождается изменением внутриклеточных метаболических процессов, в том числе образования и утилизации активных метаболитов кислорода. В литературе нет единой точки зрения относительно продукции H2О2 неоплазмой экспериментальных опухолей [8, 10]. Основная часть H2О2, ингибирующая размножение клеток, в митохондриях образуется в результате реакции дисмутации О2-, катализируемой СОД. Содержание СОД в клетках возрастает в ответ на повышение концентрации О2-. Усиленное образование H2О2, возможно, компенсируется повышенным содержанием глутатионзависимых ферментов, в частности, ГТ, участвующих в разложении перекисей. Таким образом, в динамике прогрессирования экспериментальной опухоли РШМ-5 имеет место возрастание в неоплазме уровня МДА при одновременном увеличении активности СОД и ГТ.
Таблица 2
Активность ферментов АОС опухолевой ткани РШМ при воздействии ФСЛИ
|
Эксп. Показатели |
РШМ 20 суток |
РШМ 30 суток |
||||
|
Без облучения n = 12 |
Эсред=2,4 Дж/см2 n = 12 |
Эсред=3,6 Дж/см2 n = 12 |
Без облучения n = 12 |
Эсред=2,4 Дж/см2 n = 12 |
Эсред=3,6 Дж/см2 n = 12 |
|
|
ГР, |
0,24 ± 0,008 |
0,24 ± 0,009 |
0,25 ± 0,006 |
0,21 ± 0,016 |
0,17 ± 0,004* |
0,14 ± 0,005* |
|
ГТ, |
0,47 ± 0,076 |
0,75 ± 0,070* |
0,56 ± 0,077 |
1,50 ± 0,292 |
1,74 ± 0,120 |
0,64 ± 0,065* |
|
СОД, у.е./мг |
9,23 ± 0,930 |
12,92 ± 1,920* |
17,10 ± 1,400* |
26,57 ± 2,00 |
8,15 ± 0,200* |
14,86 ± 3,410* |
|
Каталаза, ммоль/с/мг |
0,75 ± 0,345 |
0,53 ± 0,110 |
1,05 ± 0,169* |
0,54 ± 0,100 |
0,45 ± 0,073 |
0,81 ± 0,019* |
Примечание: * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных без облучения, p < 0,05.
Под влиянием ФСЛИ дозой 2,4 Дж/см2 в неоплазме на 20-е сутки развития РШМ статистически значимо возрастало количество МДА (см. табл. 1) при одновременном снижении активности каталазы и возрастании активности СОД (см. табл. 2). На 30-е сутки опухолевого роста в ткани РШМ под влиянием ФСЛИ снижалось количество МДА (см. табл. 1) и волнообразно, в зависимости от дозы ФСЛИ, изменялась активность АОС ферментов (см. табл. 2).
В работах С.Д. Захарова и А.В. Иванова [3] показано, что светокислородный эффект развивается в клетках опухоли идентично фотодинамическому эффекту, и гибели клетки при достаточно большой дозе облучения предшествуют 3 стадии. В начальной стадии реакция клетки носит характер стереотипного возбуждения и имеет определенный порог. Продолжающееся облучение приводит к нарастанию в клетке окисления. В ней приостанавливаются процессы, связанные с пролиферацией. Поток электронов и протонов, идущий в норме из клетки для «борьбы» с окислением во внешней среде, уменьшается. Часть его (пропорциональная лучевой нагрузке) участвует в клетке при замене связей типа R-O или S-S на R-H или S-H, что способствует внутренней репарации.
В результате в клетке развивается окисление. Однако предполагается, что при этом активируются антиоксидантные ферменты. Закисление сопровождается торможением гликолиза. Клетка, возможно, направляет исходные соединения гликолиза напрямую на восстановление окисленных молекул. При этом, возможно, идет разрушение лизосом, сопровождающееся высвобождением гидролаз, разрушающих субклеточные структуры, и снижением pH.
Этой стадии, вероятно, соответствует динамика изменений уровня МДА и АОС в ткани РШМ на 20-е сутки развития опухоли при ФСЛИ в дозе 2,4 Дж/см2.
Авторы полагают, что при возрастании лучевой нагрузки наступает повреждение систем ионного транспорта и осмотическое набухание клетки.
Данная схема перехода клетки от активирования к деструкции при воздействии излучения ‒ одна из многих, предложенных на сегодня, однако, она позволяет наиболее полно интерпретировать динамику компонентов системы «перекисное окисление липидов - антиоксиданты», определяющую возникновение оксидативного стресса, при воздействии на неоплазму РШМ ФСЛИ.
Согласно данным литературы [5], установившиеся опухоли характеризуются низким уровнем ненасыщенных жирных кислот и повышенным содержанием холестерина, что делает мембраны опухолевых клеток ригидными. Опухоли РШМ на 30-е сутки развития, видимо, следует относить к установившимся. ФСЛИ в использованных дозах не изменяет в клетках опухоли уровня МДА и приводит к снижению активности ферментов АОС, что, в свою, очередь, также может быть интерпретировано, как оксидативный стресс.
Заключение
Результаты изучения влияния различных доз ФСЛИ на неоплазму при экспериментальном РШМ позволяют предполагать развитие в клетках оксидативного стресса, наиболее выраженного на 20-е сутки роста опухоли, при средней дозе ФСЛИ 2,4 Дж/см2.
Работа поддержана грантом ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.».
Рецензенты:
Антонеева И.И., д.м.н., зав. гинекологическим отделением ГУЗ «Областной клинический онкологический диспансер», г. Ульяновск;
Каталымов Л.Л., д.б.н., профессор кафедры анатомии, физиологии и гигиены человека ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова», г. Ульяновск.
Работа поступила в редакцию 23.11.2011.