Пусковым моментом развития раневого процесса являются повреждение тканей и микробная инвазия. Раневой процесс - сложный комплекс биологических реакций организма, развивающийся в ответ на повреждение тканей и направленный на их заживление. В ходе его имеют место деструктивные и восстановительные изменения тканей, образующих рану и прилегающих к ней - соединительной, эпителиальной, нервной, мышечной.
С позиций общей патологии, таким образом, раневой процесс представляет собой частный случай воспаления, проявляющегося сочетанием местных деструктивно-воспалительных изменений и общих реакций.
По современным данным, течение раневого процесса условно подразделяют на 3 основные фазы: 1-й фаза - фаза воспаления; 2-й фаза - фаза регенерации 3-й фаза - фаза организации рубца и эпителизации.
В зависимости от степени повреждения тканей, отсутствия или наличия микробного загрязнения и некоторым другим причинам, раны заживают по трём основным типам:
- по первичному натяжению без нагноения при слабо выраженных явлениях серозного воспаления;
- по вторичному натяжению, путём гранулирования, при более или менее выраженном гнойном воспалении (так заживают случайные, огнестрельные и колотые раны) - накладывать швы на такие раны недопустимо;
- под струпом, преимущественно у грызунов и птиц, а также при неглубоких ранах у рогатого скота и свиней.
В современной клинической хирургии общепризнанным считается положение, что любая случайная рана является бактериально загрязненной, или первично инфицированной. Под термином «бактериально загрязненная рана» следует понимать такое состояние раны, когда общие и локальные механизмы защиты способны подавить попавшие в рану микроорганизмы и не наблюдается никаких клинических признаков инфекционного процесса в ране.
Принято различать первичное и вторичное микробное загрязнение раны. Первичное загрязнение наступает в момент нанесения раны и характерно для травматических и огнестрельных ран. Вторичное загрязнение раны связано с нарушением правил антисептики во время перевязок и операций и часто является следствием внутренней госпитальной инфекции. Следовательно, само по себе присутствие микробов в ране (даже патогенных, не говоря уже о группе условно-патогенных микробов) еще не делает развитие инфекции в ране обязательным.
Инфекция в ране развивается при нарушении равновесия между микроорганизмами, загрязняющими рану, и защитными силами макроорганизма, что проявляется клиническими симптомами воспаления. С клинической точки зрения, ведущим фактором, определяющим возможность перехода бактериально-загрязненной раны в инфицированную, является функциональное состояние поврежденных тканей [4, 5].
Воспаление является универсальной реакцией организма на воздействие экзогенных и эндогенных повреждающих факторов, к которым относятся токсины бактерий, вирусов, а также аллергические, физические и химические агенты [6].
Воспалительные реакции могут иметь чрезмерно выраженный характер, что приводит к нарушению функций органов и тканей [6]. В реакции воспаления выделяют фазы альтерации, экссудации и пролиферации. Возможность экспериментального выделения отдельных фаз воспаления широко используется для исследования противовоспалительных средств с целью выявления и отбора новых соединений, а также сравнения эффективности известных классов веществ в эксперименте и клинике.
Разработка лекарственных средств, основой которых служит растительное сырье, является перспективным направлением современного фармацевтического производства. Истинный потенциал лекарственных растений, несмотря на длительный срок их применения в народной и официнальной медицине, раскрыт далеко не полностью. По мере исследований новых объектов появляются оригинальные аспекты как в плане применения, так и в технологии фитопрепаратов, использовании новых видов сырья, экстрагентов, путей интенсификации процесса экстракции.
Преимущество фитопрепаратов объясняется, прежде всего, эффективностью, мягким действием и малой токсичностью, что позволяет использовать их длительное время для профилактики и лечения многих заболеваний без риска возникновения побочных явлений. Поэтому фитопрепараты достаточно востребованы, доля их на Российском фармацевтическом рынке значительна, но номенклатура и объем предложения ниже растущей с каждым годом потребности. В наибольшей степени это касается мягких лекарственных форм для наружного применения, используемых для лечения дерматологических заболеваний.
Мази на основе фитокомплексов из лекарственных растений, обладающие антимикробной и противовоспалительной активностью, широко используются в медицинской практике для лечения различных инфекционных гнойно-воспалительных, аллергических и травматических поражений кожи. Перспективным источником получения таких препаратов являются представители семейства ивовых (Salicaceae), в частности, виды рода тополь (Рорulus L.), учитывая тот факт, что почки тополя содержат богатый набор биологически активных веществ (БАВ), представляющих собой флавоноиды, фенилпропаноиды, простые фенолы, эфирные масла и др. Широко известны данные об успешном применении спиртовых экстрактов почек тополя.
Традиционно спирто-водные и масляные извлечения из сырья получают раздельно, используя либо масляные, либо спирто-водный экстрагент. При такой технологии экстракция происходит неполно и в отходах производства остается значительное количество биологически активных веществ. Одним из новых методов получения природных комплексов БАВ, является экстракция растительного сырья двухфазной системой экстрагентов. Этот способ позволяет в одной технологической операции извлекать из растительного сырья и липофильные, и гидрофильные соединения, что обеспечивает расширение компонентного состава, большую степень извлечения БАВ и эффективность технологического процесса. Нами была разработана технология получения двухфазного экстракта из почек тополя (Populus nigra L.), содержащего состав БАВ, наиболее близкий к природному, с целью создания на его основе мази, обладающей противовоспалительным и антибактериальным действием [7, 8, 9].
Актуальность использования фитокомплеса почек тополя черного в мазях доказывается и тем фактом, что при сравнении химического состава почек тополя и прополиса показано, что по составу они близки, но у почек отмечается более высокое содержание биологически активных веществ и, как следствие, более высокая антимикробная активность. Экспериментально установлено, что антимикробная активность почек тополя (различных видов) обусловлена не эфирным маслом, а в основном флавоноидами (пиноцембрин, пиностробин, 2´,6´ - дигидро - 4´ - метоксихалкон и др.) и фенилпропаноидами (кофейная, феруловая кислоты, изопентилкофеат и др.) [1, 2].
В связи с этим стандартизацию почек тополя предложено проводить по содержанию суммы флавоноидов и гидроксикоричных кислот в пересчете на пиностробин, так как согласно изучению микробиологической активности, антимикробные свойства экстрактов их почек тополя обусловлены наличием флавоноидов, в частности пиноцембрина и пиностробина, и гидрокоричных кислот [3].
Целью исследования явилось изучение антимикробной и противовоспалительной активности мази с двухфазным экстрактом почек Populus nigra L.
Нами было изучено противомикробное действие двухфазного экстракта почек тополя черного и мази на его основе. Микробиологическому исследованию были подвергнуты двухфазный экстракт тополевых почек, мазь, а также основа - сплав ПЭО-400 и ПЭО-1500. Определение чувствительности патогенных микроорганизмов к экстракту, к мази и к основе проводили, используя метод диффузии в агар (способ «колодцев»).
Метод основан на оценке угнетения роста тест-микроорганизмов определенными концентрациями испытуемого средства.
Для проверки антимикробного действия использовали 24-часовые тест-культуры, выращенные на скошенном мясопептонном агаре (МПА). Микробные культуры с МПА смывали 2-3 мл физиологического раствора и готовили взвесь, содержащую 500 млн микробных тел в 1 мл по стандарту мутности.
На поверхность агара в чашках Петри одинакового диаметра делали посев сплошным газоном стандартных взвесей используемых тест-культур. Для этого толстый слой агара засевали 1-2 мл взвеси и растирали шпателем для равномерного распределения микробов по всей поверхности чашки Петри. Излишек взвеси полностью удаляли, подсушивали в течение 30 минут. Стерильным сверлом (d = 6 мм) делали 6 лунок («колодцев») на расстоянии 2,5 см от центра и на одинаковом расстоянии друг от друга, лунки через одну заполняли исследуемыми экстрактом, мазью и основой. Под крышку чашки Петри помещали стерильный фильтр во избежание попадания конденсата на лунки. Все чашки Петри ставили в термостат (37 °С) на 18-20 часов строго горизонтально для получения круглых зон угнетения роста микрофлоры.
После инкубации проводили оценку результатов по диаметру зон задержки роста тест-культур микроорганизмов вокруг колодца, включая диаметр самого колодца. Диаметр зон угнетения роста измеряли с помощью миллиметровой бумаги. В некоторых случаях зоны угнетения имели овальную форму. Поэтому в таких случаях измеряли наибольший и наименьший диаметры зоны и вычисляли среднюю величину, которая и принималась за показатель.
В качестве тест-культур использовали следующие культуры микроорганизмов:
1. Staphylococcus aureus (209).
2. Staphylococcus aureus (Type).
3. Staphylococcus epidermidis Wood-46.
4. Escherichia coli 675.
5. Escherichia coli 055.
6. Salmonella typhimurium.
7. Shigella flexneri.
8. Shigella sonnei 3d.
9. Pseudomonas aeruginoza.
10. Bacillus subtilis L2.
11. Bacillus anthracoides - 96.
Между степенью чувствительности микроорганизмов к антибактериальному компоненту и размером диаметра зоны угнетения роста культур имеются следующие соотношения:
- Менее 10 мм - нет чувствительности.
- 10 мм - умеренная чувствительность.
- Более 10 мм - высокая чувствительность.
Результаты исследования представлены в табл. 1.
Из представленных данных видно, что двухфазный экстракт почек тополя черного обладает бактериостатическим действием в отношении Escherichia coli 055, Bacillus subtilis L2 и выраженной бактерицидной активностью в отношении всех остальных используемых в опыте кокковых культур, бацилл и энтеробактерий.
Установлено, что 20 %-я мазь на основе двухфазного экстракта также обладает антибактериальной активностью: в отношении кокковых культур, Shigella sonnei 3d, Bacillus anthracoides-96 выражено ее бактерицидное действие, в отношении остальных используемых тест-культур - бактериостатическое. Чувствительность используемых тест-культур к основе - сплав ПЭГ-400 - ПЭГ-1500 отсутствует.
В руководстве по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ предложено несколько методических тестов для оценки противовоспалительного эффекта исследуемых веществ [2].
Представляло интерес определить влияние мази с двухфазным экстрактом почек тополя черного на развитие экссудативной фазы воспаления, а также влияние на пролиферативные процессы.
Антипролиферативное и противоотечное свойства мази с двухфазным экстрактом почек тополя оценивали на модели с имплантированными под кожу животных стерильных ватных шариков одинаковой массы (15 мг). Противовоспалительный эффект проявляется в способности изучаемых средств уменьшать объем экссудата и образование грануляционной ткани в воспалительном очаге, развивающемся в месте травмирования кожи. Эксперимент проводили на 18 взрослых белых крысах обоего пола весом 200-230 г.
Таблица 1
Результаты изучения антимикробной активности двухфазного экстракта почек тополя и мази на его основе
|
Используемые |
Диаметр зон задержки роста тест-культур, мм |
||
|
Двухфазный экстракт почек тополя черного |
20 %-я мазь |
Основа - сплав |
|
|
1 |
16 б/цид |
14 б/цид |
6 б/ст |
|
2 |
15 б/цид |
12 б/цид |
6 б/ст |
|
3 |
14 б/цид |
12 б/цид |
5 б/ст |
|
4 |
11 б/цид |
10 б/ст |
6 б/ст |
|
5 |
13 б/ст |
11 б/ст |
6 б/ст |
|
6 |
13 б/цид |
11 б/ст |
6 б/ст |
|
7 |
14 б/цид |
12 б/ст |
7 б/ст |
|
8 |
15 б/цид |
14 б/цид |
6 б/ст |
|
9 |
15 б/цид |
13 б/ст |
7 б/ст |
|
10 |
12 б/ст |
10 б/ст |
5 б/ст |
|
11 |
14 б/цид |
13 б/цид |
6 б/ст |
У крыс, находящихся под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг внутрибрюшинно), в области спины выстригали шерсть на площади около 6 см2. В асептических условиях скальпелем делали разрез кожи и подкожной клетчатки длиной 1 см, пинцетом через разрез формировали полость, в которую помещали предварительно взвешенный стерильный ватный шарик, после этого рану зашивали. Место разреза кожи с первого дня ежедневно обрабатывали исследуемой мазью с двухфазным экстрактом почек тополя. В группе сравнения шов смазывали мазью календулы, выпускаемой отечественной фармацевтической промышленностью. Группа контроля (6 крыс) находилась в условиях самоизлечения. Все время опыта животные находились в равных условиях, на стандартном питании вивария, воду получали без ограничения. Состояние животных было обычным, нормальным со стороны всех физиологических показателей деятельности систем организма.
На 8-й день шарики, превратившиеся в гранулемы, извлекали в условиях наркоза. Мокрые экспериментальные гранулемы сразу же взвешивали на торсионных весах. С целью характеристики влияния исследуемых объектов на развитие фаз воспалительного процесса шарики-гранулемы высушивали в сушильном шкафу до тех пор, пока их масса не стала изменяться. О величине экссудативной фазы воспаления судили по разнице в массе гранулем до и после высушивания. О величине пролиферативной фазы - по разнице в весе высушенных гранулем и ватных шариков.
Полученные результаты обработаны статистически и представлены в табл. 2.
Таблица 2
Результаты изучения антипролиферативного и противоотечного действия
разработанной мази
|
Исследуемый |
Вес гранулемы, мг |
Экссудация, мг |
Пролиферация, мг |
|
|
до высушивания |
после высушивания |
|||
|
Контроль |
270,5 ± 11,04 |
55,4 ± 2,53 |
215,1 ± 5,37 |
40,4 ± 1,81 |
|
Мазь календулы |
234,5 ± 17,280 |
50,5 ± 2,880 |
184,0 ± 6,08Х‒14,5 % |
35,5 ± 3,020‒12,0 % |
|
Мазь с двухфазным экстрактом почек тополя |
226,0 ± 9,14Х |
47,2 ± 2,04Х |
178,8 ± 4,53Х‒17,0 % |
32,2 ± 1,23Х‒20,3 % |
Примечания:
х - изменения достоверны относительно контроля (р < 0,05);
0 - изменения недостоверны относительно контроля (р > 0,05);
% - изменение в % относительно контроля.
Результаты опыта показали, что мазь с двухфазным экстрактом почек тополя достоверно снижает величину отека относительно контроля на 17 %.
Результат антиэкссудативной активности мази календулы достоверно меньше контроля на 14,5 %. В сравнительном плане не наблюдали достоверных отличий в противоотечном действии мази с двухфазным экстрактом почек тополя черного и препарата - сравнения мази календулы.
Образование грануляционной ткани на фоне исследуемой мази достоверно тормозилось в сравнении с контролем на 20,3 %; под влиянием мази календулы снижалось на 12 % недостоверно относительно контроля. В сравнительном аспекте в наших исследованиях не было достоверных различий в синтезе фиброзной ткани на фоне мази с двухфазным экстрактом почек тополя черного и мази календулы (на 8,3 %).
Установлено в эксперименте, что мазь с двухфазным экстрактом почек тополя обладает противовоспалительной активностью. Причём данный эффект проявляется как в фазу экссудации, так и в фазу пролиферации хронического пролиферативного воспаления.
По сравнению с мазью календулы мазь на основе двухфазного экстракта почек тополя проявляет некоторую тенденцию к уменьшению воспалительного процесса, однако, статистически достоверных различий между группой, получавшей исследуемую мазь и группой, получавшей мазь календулы, не наблюдалось.
Выводы
Проведенные микробиологические исследования показали, что двухфазный экстракт почек тополя черного и мазь на его основе обладают выраженным противомикробным действием.
Установлено выраженное противовоспалительное действие разработанной мази с двухфазным экстрактом почек тополя черного, сопоставимое с действием мази календулы.
Рецензенты:
Молчанов Г.И., д.ф.н., профессор кафедры социально-гуманитарных наук Пятигорского филиала ГОУ ВПО Северо-Кавказского ГТУ, г. Пятигорск;
Ефименко Н.В., д.м.н., профессор, зам. директора по науке ФГУ «Пятигорский ГНИИ Курортологии ФМБА России», г. Пятигорск.
Работа поступила в редакцию 28.10.2011.