Актуальность исследования гистологического строения перитуморозной зоны (ПЗ) рака почки и нарушения течения биосинтетических процессов происходящих в ней, возникает в связи с распространением в хирургии опухолей почки органосохраняющей тактики [4].
Отсутствие целенаправленных патологоанатомических исследований по исследованию ПЗ рака почки позволяет ряду авторов говорить, что наличие макроскопически «чистого» хирургического края при выполнении резекции почки позволяет отказаться от срочного гистологического исследования, которое из-за большого количества ложноотрицательных и ложноположительных результатов должно выполняться по усмотрению оперирующего хирурга [7, 10]. Другие авторы напротив сообщают, что органосохраняющие операции опухолей, размер которых был меньше, чем 4 см, сопровождались 27 %-м уровнем инвазии в перитуморозную псевдокапсулу [12]. Так, Minervini A. и соавт. (2009) показали, что увеличение размера опухоли даже на 1 см значительно увеличивали число случаев обнаружения роста опухолевых клеток в перитуморозной псевдокапсуле. C другой стороны, существует и другая крайность, когда оперирующие хирурги иссекают прилегающую паренхиму почки на расстоянии 3-4 см [2].
Есть основания полагать, что гистологическое строение ПЗ и биологическое поведение опухоли взаимосвязаны между собой. Так, Авдалян А.М. и соавт. (2010), по данным выявления белка CD31 и активности ядрышковых организаторов эндотелия, показали, что плотность микроциркуляторного русла (ПМЦР) ПЗ влияло на выживаемость больных лейомиосаркомой (ЛМС) матки в большей степени, чем ПМЦР в самой опухоли и ПМЦР ПЗ являлась независимым прогностическим предиктором при ЛМС тела матки относительно стадии и степени злокачественности. Нашими исследованиями показано, что ПМЦР ПЗ рака почки была взаимосвязана с обнаружением отдаленных метастазов, а наличие полиплоидии и анеуплоидии в карциномах почки приводило к появлению очагов пролиферации и дисплазии в эпителии канальцев перитуморозной области [1].
Общепризнано, что аргирофильные кислые негистоновые белки ядрышка С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин) взаимосвязаны с пролиферативной активностью клетки и выявление данных белков, пожалуй, является единственным из доступных методов исследования скорости пролиферации клеточных элементов [11]. Поэтому было интересно изучить гистологическое строение ПЗ рака почки, в зависимости от активности ядрышковых организаторов опухолевых клеток.
Цель исследования: изучить особенности гистологического строения ПЗ, а также биосинтетических и пролиферативных процессов ее клеточных элементов, в зависимости от активности ядрышковых организаторов опухолевых клеток.
Материал и методы исследования
Изучен операционный материал 42 больных раком почки. Средний возраст пациентов составил 57,4 ± 1,4 года. Мужчин было 25 (59,5 %), женщин - 17 (40,5 %). По гистологическому строению опухоли были представлены следующим образом: светлоклеточный рак - 28; зернистоклеточный рак - 8; папиллярный рак - 5 и веретеноклеточный рак - 1. Материал забирали из центра опухоли, ПЗ (за ПЗ принимали непосредственно прилижащую в псевдокапсуле опухолевую ткань, псевдокапсулу и ткань расположенную за псевдокапсулой до неизмененной ткани почки) и неизмененной ткани почки, из максимально отдаленных от опухоли участков.
При группировке опухолей по клиническим стадиям (Ι-ΙV) было выделено: Ι стадии (T1N0M0) соответствовали 22 (52,4 %) наблюдения; ΙΙ стадии (T2N0M0) 1 (2,4 %) наблюдение; ΙΙΙ стадии (T1N1M0, T2N1M0, T3N0M0, T3N1M0) - 8 (19 %) и ΙV стадии (T4N0M0, T4N1M0, TлюбаяN2M1, TлюбаяNлюбаяM1) - 11 (26,2 %). Степень злокачественности клеток опухоли оценивали по Fuhrman S.A. et al., (1982) [8]. В нашем материале было 2 (4,8 %) опухолей степени анаплазии G1; 11 (26,2 %) опухолей степени анаплазии G2; 22 (52,4 %) степени анаплазии G3 и 7 (16,7 %.) степени G4.
При анализе биосинтетических и пролиферативных процессов элементов перитуморозной зоны использовался комплексный подход с применением различных методов окраски: гистологических - окраска гематоксилином и эозином; гистохимических - окраска на коллаген по ван Гизон; на эластические волокна - резорцин - фуксином по Вейгерту; серебрение аргирофильных волокон по Гомори; на нейтральные гликозаминогликаны (ГАГ) ШИК - реакция по Мак - Манусу; на кислые ГАГ - окраска альциановым синим по Стидмену и коллоидным железом по Хейлу; на ДНК по Фельгену; на общие нуклеиновые кислоты по Эйнарсону и на активность аргирофильных белков, ассоциированных с областью ядрышковых организаторов (AgNOR) по Daskal Y и соавт. [6], в модификации авторов [5]. Подсчитывали среднее число гранул серебра (AgNORs) на1 ядро клетки и строили гистограммы распределения популяций клеток по количеству AgNORs. В каждом случае исследовали 25-30 клеток.
Выделяли две группы исследования:
1) 5 и менее гранул AgNORs в опухолях;
2) более 5 гранул AgNORs в опухолях.
Также в каждом случае на масляной имерсии при увеличении х1000 расчитывали плотность микроциркуляторного русла (ПМЦР) в 20 произвольно выбранных полях зрения.
Морфометрические и микроспектрофотометрические исследования проводили с использованием системы компьютерного анализа изображений, состоящей из микроскопа Leica DМЕ, цифровой камеры Leica EС3 («Leica Microsystems AG», Германия), персонального компьютера Pentium 4 и программного обеспечения ВидиоТест - Морфология 5,2. Плоидометрию ДНК проводили на гистологических срезах, окрашенных по Фельгену. Среднее содержание ДНК в ядрах малых лимфоцитов принимали за диплоидное (2 с) и использовали в качестве стандарта. Для получения стандарта в каждом срезе оценивали 25-30 лимфоцитов. Затем в исследуемых клетках высчитывали индекс накопления ДНК (ИНДНК) в единицах плоидности (с) и строили гистограммы клонального распределения клеток по количеству генетического материала, выраженного в процентах.
Статистический анализ
Статистическую обработку материала проводили при помощи статистического пакета Statistica 6.0. При нормальном распределении данных при проверке статистических гипотез применяли методы параметрической статистики (t - test Стьюдента), а если полученные данные не соответствовали критериям нормального распределения (критерий Шапиро-Уилка W = 0,89, p < 0,01), то применяли методы непараметрической статистики: тест Колмогорова-Смирнова или U-тест Манна-Уитни. Данные считали достоверными при р < 0,05. Анализ зависимости между признаками проводили с помощью r-критерия Пирсона.
Результаты исследования и их обсуждение
В неизмененном эпителии канальцев почки число гранул AgNORs составило 3,1 ± 0,1 на 1 ядро (рис. 1). В ядрах рака почки количество AgNORs колебалось от 1 до 68 и в среднем составило 9,6 ± 0,3 на 1 ядро.
В процессе исследования материал нами был распределен на 2 группы. В I группу вошли пациенты, опухоли которых содержали 5 и менее гранул AgNORs (в среднем 5,4 ± 0,15), а группу II составили больные, опухоли которых содержали более 5 гранул AgNORs (в среднем 15,6 ± 0,5). В I группу вошло 18 (42,95 %) больных, во II группу - 24 (57,1 %).
Для исследования процентного распределения популяций клеток по количеству гранул серебра для каждой группы были построены гистограммы распределения. Гистограмма распределения ядер по количеству гранул серебра в I группе имела унимодальный характер с пиком в области популяции клеток, содержащий от 1 до 5 аргентофильных гранул (рис. 2, 3).
Рис. 1. Активность AgNOR в ядрах неизмененного эпителия канальцев почки (гранулы в ядрышках показаны стрелками). Окраска нитратом серебра, увеличение х 1000
Рис. 2. Гистограмма, характеризующая распределение клеток опухолей
по количеству AgNORs в группе I. По оси абсцисс - количество AgNORs;
по оси ординат - процентное содержание клеток
Рис. 3. Активность AgNOR в клетках опухолей пациентов І группы
(гранулы в ядрышках показаны стрелками). Окраска нитратом серебра, увеличение х 1000
Иной вид имела гистограмма распределения ядер по числу гранул серебра на 1 ядро во II группе. Она была растянута вправо за счет клеток с высоким содержанием гранул. Другими особенностями гистограммы являлись многовершинность и отсутствие высоких пиков, что отражает широкую вариабельность популяций клеточных элементов по содержанию гранул серебра (рис. 4, 5).
Рис. 4. Гистограмма, характеризующая распределение клеток опухолей
по количеству AgNORs в группе II. По оси абсцисс - количество AgNORs;
по оси ординат - процентное содержание клеток
Рис. 5. Активность AgNOR в клетках опухолей пациентов ІІ группы. AgNORs в ядрышках
очень мелкие, на пределе видимости светового микроскопа (ядрышки показаны стрелками).
Окраска нитратом серебра, увеличение х 1000
ПЗ злокачественных новообразований почки имела различное гистологическое строение. Ширина ее колебалась от 152,5 до 2593,2 мкм и в среднем составила - 954,7 ± 89,5. Размеры и гистологическое строение ПЗ зависели от активности AgNOR в опухолевых клетках (таблица).
Морфометрические параметры элементов ПЗ в зависимости
от активности AgNOR опухоли
|
Параметры ПЗ |
Число AgNORs в опухоли |
|
|
5 и менее AgNORs |
Более 5 AgNORs |
|
|
Ширина перитуморозной зоны, мкм |
520,4 ± 43,2* |
1320 ± 73,6* |
|
Площадь ядер эпителия канальцев, мкм2 |
37,9 ± 2,0* |
54,2 ± 5,3* |
|
Площадь ядер миофибробластов, мкм2 |
33,5 ± 2,2* |
66,7 ± 3,2* |
|
Плотность сосудов микроциркуляции |
5,9 ± 0,5* |
8,9 ± 0,6* |
|
Число AgNORs в ядрах миофибробластов |
1,5 ± 0,2* |
2,8 ± 0,4* |
|
Число AgNORs в ядрах эпителия канальцев |
2,2 ± 0,2* |
5,15 ± 0,35* |
|
Число AgNORs в ядрах эндотелия |
1,7 ± 0,1* |
3,5 ± 0,4* |
Примечание: * - p < 0,05.
Так, у опухолей больных I группы ширина ПЗ в среднем составила 520,4 ± 43,2 мкм. В ПЗ отмечались явления умеренно выраженного склероза. Коллагеновые волокна при окраске по ван Гизону в таких ПЗ окрашивались в розоватый цвет с участками желтого, в то же время волокна коллагена были ШИК-позитивны при реакции по Мак-Манусу на нейтральные ГАГ. Кислые ГАГ в соединительной ткани не обнаруживались, но определялись в стенках сосудов. При окраске на эластические волокна резорцином-фуксином по Вейгерту отмечено небольшое число тонких извитых волокон, эластические мембраны на границе с опухолью обнаруживались лишь на некоторых участках. В пучках коллагеновых волокон определялись тонкие «штопорообразные» аргирофильные волокна. Плотность лимфо-плазмоцитарной инфильтрации была слабой или умеренной.
У пациентов ΙΙ группы ширина ПЗ опухолей в среднем составила 1320,3 ± 73,6 мкм. Отмечались явления выраженного склероза. При окраске по ван Гизон в таких ПЗ обнаруживалась выраженная фуксинофилия коллагеновых волокон, волокна давали интенсивную ШИК-реакцию при окраске по Мак-Манусу на нейтральные ГАГ. При окраске на эластические волокна резорцином-фуксином по Вейгерту отмечено большое число тонких извитых волокон интенсивной сиреневой окраски, также отмечались толстые эластические мембраны на границе между опухолевой тканью и ПЗ. Аргирофильные волокна были утолщены, на границе ПЗ с опухолью они образовывали сплетения и мембраны. Кислые ГАГ отмечали в значительном количестве в зонах обнаружения эластических волокон. Плотность лимфо-плазмоцитарной инфильтрации в ПЗ была умеренной или высокой, часто были видны фолликулоподобные структуры.
В ПЗ, в различном количестве, обнаруживались элементы канальцевого аппарата почки. В Ι группе ядра клеток эпителия канальцев были округлой формы, небольшого размера, гиперхромность отсутствовала. Площадь клеточного ядра составила 37,9 ± 2,0 мкм2. Клетки располагались на тонкой ШИК-положительной базальной мембране. Количество AgNORs в ядрах составило в среднем 2,2 ± 0,2 на 1 ядро.
В ПЗ ΙΙ группы исследования почечных канальцев было значительно больше, они располагались в плотной соединительной ткани и содержали небольшое число клеточных элементов. Такие канальцы были окружены резко ШИК-положительной базальной мембраной. При окраске нитратом серебра по Гомори базальная мембрана выглядела утолщенной. Клетки нефротелия имели признаки атипизма: полиморфизм и гиперхромию ядра, увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения, большое количество общих НК. Площадь клеточного ядра с среднем составила 54,2 ± 5,3 мкм2. Число AgNORs в ядрах клеток достигало 5,15 ± 0,35 на 1 ядро. В участках таких видоизмененных канальцев невозможно было дифференцировать различные отделы нефрона.
При микроспектрофотометрическом исследовании ДНК в клетках эпителия канальцев ПЗ в Ι группе исследования содержание ДНК составило 3,6 ± 0,1 с, что может говорить о гиперпластических и пролиферативных процессах, происходящих в эпителии. Гистограмма распределения клеток по количеству ДНК для этой группы характеризовалась пиками на уровнях 3 и 4 с. Во ΙΙ группе пациентов было обнаружено увеличение среднего содержания ДНК до 5,3 ± 0,1 с, что свидетельствует о тяжелой дисплазии. Увеличение среднего содержания ДНК в клетках сопровождалось нарастанием гетерогенности популяций по содержанию генетического материала, явлениями анеуплоидии и полиплоидии и возникновением клонов, содержащих 6 и 7 с ДНК, что свидетельствует о нарастающей генетической нестабильности эпителия. Данные гистограммы были неотличимы от гистограмм рака (рис. 6).
Морфометрические параметры элементов ПЗ в зависимости от плоидности опухоли
Рис 6. Гистограмма распределения ДНК в ядрах почечного эпителия в норме и перитуморозной зоне диплоидных и полиплоидных опухолей. По оси абсцисс - количество ДНК (в единицах плоидности); по оси ординат - количество клеток (в процентах)
Ядра клеток миофибробластического ряда ПЗ I группы пациентов имели удлиненную волнообразную форму. Площадь ядра в среднем составила - 32,4 ± 2,2 мкм2. Число AgNORs составило 1,5 ± 0,2 на 1 ядро. Такие клетки нами были отнесены к зрелым малоактивным фиброцитам. В группе ΙΙ клетки миофибробластического ряда имели увеличенные ядра. Площадь ядра в среднем составила 66,7 ± 3,2 мкм2. Число AgNORs в таких клетках составило 2,8 ± 0,4 на 1 ядро. Данные клетки можно отнести к активно синтезирующим юным фибробластам.
При исследовании ПМЦР в ПЗ установлено вовлечение сосудов в патологический неоангиогенез. В большинстве случаев новообразованные сосуды не имели мышечной оболочки, имели трубчатое или лакунарное строение и были образованы одним слоем эндотелиоподобных клеток. В ПЗ Ι группы ПМЦР составила - 5,9 ± 0,5, во ΙΙ группе - 8,9 ± 0,6. Также отмечали возрастание числа AgNORs до 1,7 ± 0,1 в эндотелии новообразованных сосудов ПЗ Ι группы, по сравнению со ΙΙ группой (3,5 ± 0,4). В собственных сосудах почки, которые также в небольшом количестве находили в ПЗ обеих групп, отмечали явления выраженного эластофиброза и гиалиноза, с сужением либо облитерацией просвета. ПМЦР в ПЗ коррелировала с наличием региональных и отдаленных метастазов (r = 0,76).
Заключение
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что активность AgNOR клеток опухоли была взаимосвязана с гистологическим строением ПЗ рака почки. При этом можно говорить о соноправленности процессов пролиферации (по данным измерения ДНК) и активности рибосомального синтеза в опухолевых клетках (по данным серебрения AgNOR), которая, как известно, характеризует скорость пролиферации.
По нашему мнению, полученные данные имеют не только теоретическое значение, но и практический интерес. Мы считаем, что при органосберегающих операциях следует проводить более тщательную ревизию хирургического края опухолей с высокой активностью AgNORs (более 5 гранул). Высокая активность ангиогенеза в ПЗ опухолей с большим содержанием AgNOR должна обусловливать настороженность в отношении кровотечения. Четкая псевдокапсула опухоли, наличие которой, как известно, является показанием в органосберегающей операции, может быть обусловлена выраженным склерозом, что может затруднить выделение опухоли. С другой стороны, наличие четкой и широкой капсулы (по данным инструментальных методов исследования) может говорить о высокой степени клеточной градации опухоли.
Интересным, на наш взгляд, является тот факт, что опухоли с небольшим количеством гранул (5 и менее) характеризовались низкой степенью анаплазии (G1-G2) и малым размером (около 4 см). Инвазии в ПЗ, склероза и дисплазии в таких опухолях нами не обнаружено, а ширина ПЗ в опухолях была небольшой (около 0,5 см). По нашему мнению, это следует учитывать при органосохраняющих операциях и ограничиться иссечением прилегающей к опухоли паренхимы почки в пределах, не превышающих 0,5-1 см.
Таким образом, исследование строения ПЗ в зависимости от активности AgNOR может иметь не только фундаментальный, но и практический интерес.
Рецензенты:
Высоцкий Ю.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой нормальной анатомии человека ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет», г. Барнаул;
Калачев Е.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой анатомии, физиологии и валеологии ГОУ ВПО «Алтайской государственной педагогической академии», г. Барнаул.
Работа поступила в редакцию 10.11.2011.