С позиции патологии клеточных и субклеточных процессов многие заболевания имеют общие патогенетические звенья даже в тех случаях, когда их клинические проявления, связанные с поражением различных органов и тканей, не однотипны. В связи с тем, что практически любая патология реализуется на клеточном уровне, а универсальным для всех клеток является их мембранное построение, то становится понятным, что нарушения в структуре цитоплазматических и внутриклеточных биомембран являются общими патогенетическими элементами любого болезненного процесса [4, 6].
В одних случаях повреждение клеточной оболочки может быть первичным и влечет за собой каскад специфических изменений (например, усиленная пролиферация клеток, нарушение агрегации эритроцитов и др.), в других - оказывается вторичным, как результат нарушения регуляторных процессов, что способствует многократному усилению патологических механизмов вследствие неизбежного включения цепи связанных между собой внутриклеточных сигнальных процессов [2, 5, 15]. При этом возможно нарушение транскрипции генов определенных функциональных белков или ферментов, приводящее, в свою очередь, к той или иной степени клеточной дисрегуляции. Указанное обстоятельство обусловливает теоретическую универсальность и эффективность лекарственных препаратов, направленных на репарацию поврежденных клеточных мембран. В этом смысле на первый план можно поставить препараты, созданные на основе фосфолипидов - универсальных компонентов всех клеточных оболочек [6, 13, 14].
Одним из таких препаратов является «Фосфоглив» - новое лекарственное средство, которое содержит два активно действующих вещества: фосфатидилхолин и глицирризиновую кислоту, что позволяет выполнять роль «мембранного клея», способного репарировать дефекты поврежденных мембран. Такое удачное сочетание позволили «Фосфогливу» хорошо зарекомендовать себя в качестве высокоэффективного гепатопротектора [3, 14].
Цель исследования - установление эффективности использования различных лекарственных форм препарата «Фосфоглив» в коррекции белково-липидного спектра мембран красных клеток крови у животных в условиях острого индометацинового токсического поражения печени.
Материал и методы исследования
Эксперименты проводили на 178 здоровых половозрелых крысах линии Вистар, массой 180-210 г. В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все исследования проводили в одно и то же время суток, с 8 до 12 ч, с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986) и согласно правилам лабораторной практики РФ (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.).
Острое токсическое поражение печени (ОТПП) моделировали внутрижелудочным введением индометацина (трехкратно, с интервалом 24 ч, по 5 мг/кг) [1]. Токсикант вводили в последние 3 дня получения препаратов «Фосфоглива», который вводили через 24 часа внутрижелудочно («Фосфоглив» и «Фосфоглив Форте» в 1 %-й крахмальной суспензии) и внутрибрюшинно («Фосфоглив для инъекций») по 1500 мг/кг в перерасчете на эссенциальные фосфолипиды в течение 14 дней.
Эритроциты получали из 5 мл гепаринизированной крови по методу E. Beutler [16]. Определяли сорбционную способность эритроцитов (ССЭ) [12] и сорбционную емкость их гликокаликса (СЕГ) [11]. О функциональном состоянии эритроцитов судили также по накоплению малонового диальдегида (МДА) [2, 10].
Мембраны эритроцитов получали методом G.T. Dodge [17]. Электрофорез проводили в присутствии додецилсульфата натрия в вертикальных пластинах полиакриламидного геля по методу U.K. Laemmli [19]. Белки окрашивали кумаси голубым R-250 по модифицированной методике G. Fairbanks [18]. Липиды выделяли методом тонкослойной хроматографии [7]. Статистическую обработку результатов исследования проводили, используя непараметрические методы [9].
Результаты исследования и их обсуждение
В условиях ОТПП, вызванного введением индометацина, у животных установлено снижение представительности α-спектрина, анкирина, белка полосы 4.5, Г-3-ФД, триглицеридов, сфингомиелинов и повышение количества белка полосы 4.1, паллидина, холестерина, свободных жирных кислот, что приводит к снижению общей сорбционной способности эритроцитов и накоплению в них МДА (рисунок).
Представительность белков и липидов в мембране эритроцитов, ССЭ, СЕГ и концентрация МДА у животных в условиях ОТПП:
1 - радиус окружности - показатели у контрольной группы животных (1 группа);
2 _________- показатели у животных с ОТПП (2 группа); 3 Ó- р < 0,05 между показателями
по отношению к 1 группе; 4 - АТБ - анионтранспортный белок,
Г-3-ФД - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, Г-S-Т - глутатион-S-трансфераза;
ЭХ - эфиры холестерина, СЖК - свободные жирные кислоты, МДГ - моно- и диглицериды,
ТГ - триглицериды, ФХ - фосфатидилхолин, ФЭ - фосфатидилэтаноламин,
ЛФХ - лизофосфатидилхолин, ФИ - фосфатидилинозитол, СМ - сфингомиелин
Известно, что фосфолипиды, составляющие существенную часть всех мембранных систем и органелл, играют основную роль в процессах трансмембранного обмена, детоксикации, а также регенерации клеток [8]. Патология печени, независимо от этиологии процесса, сопровождается повреждением мембран гепатоцитов и органелл, повышением их прочности, нарушением текучести, что в большой степени связано с потерей фосфолипидов. Известно также, что молекулы полиненасыщенного фосфатидилхолина, обладая высоким энергетическим потенциалом, в неизмененном виде встраиваются в мембраны гепатоцитов, избавляя таким образом печень от необходимости затрачивать большое количество энергии на формирование структурных и функциональных элементов мембранных систем [8, 14].
Во многих исследованиях показано воздействие полиненасыщенных эссенциальных фосфолипидов на цитоплазматическую мембрану клеток [8, 14, 15], в связи с чем нами с целью коррекции структурно-функциональных свойств мембраны эритроцитов использовались различные формы препарата «Фосфоглив».
Введение животным «Фосфоглива» per os на фоне токсического воздействия индометацина позволило нормализовать в мембране красных клеток крови концентрацию триглицеридов и частично корригировать представительность α-спектрина, анкирина, белка полосы 4.5, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, свободных жирных кислот и МДА внутри клеток (таблица).
Применение «Фосфоглива Форте» у животных в условиях ОТПП дополнительно, в отличие от предыдущей группы животных, нормализует в эритроцитарной мембране уровень анкирина и корригирует представительность паллидина и повышает, но не до уровня нормы, ССЭ (см. таблицу).
Инъекции «Фосфоглива» более эффективно корригируют и нормализуют нарушенные показатели белково-липидного спектра мембран красных клеток крови в условиях ОТПП: нормализуют количество паллидина, белка полосы 4.5, Г-3-ФД, холестерина и сфингомиелина, корригируя остальные изменённые показатели, за исключением представительности белка полосы 4.1 (см. таблицу).
Структурно-функциональные свойства красных клеток крови у животных
в условиях ОТПП и введения «Фосфоглива»
|
Измененные показатели |
ОТПП |
ОТПП + «Фосфоглив» |
ОТПП + «Фосфоглив-Форте» |
ОТПП + «Фосфоглив для инъекций» |
|
α-спектрин |
↓ |
коррекция |
коррекция |
коррекция |
|
Анкирин |
↓ |
коррекция |
нормализация |
нормализация |
|
4.1 |
↑ |
- |
- |
- |
|
Паллидин |
↑ |
- |
коррекция |
нормализация |
|
4.5 |
↓ |
коррекция |
коррекция |
нормализация |
|
Г-3-ФД |
↓ |
коррекция |
коррекция |
нормализация |
|
ССЭ |
↓ |
- |
коррекция |
коррекция |
|
МДА |
↑ |
коррекция |
коррекция |
коррекция |
|
Холестерин |
↑ |
- |
- |
нормализация |
|
Свободные жирные кислоты |
↑ |
коррекция |
коррекция |
коррекция |
|
Триглицериды |
↓ |
нормализация |
нормализация |
нормализация |
|
Сфингомиелин |
↓ |
- |
- |
нормализация |
Примечание: ↑ - повышение; ↓ - снижение; в таблице представлены показатели, измененные в условиях ОТПП.
Известно, что между мембранами эритроцитов и компонентами липидного спектра сыворотки крови постоянно происходит обмен, потому встраивание фосфатидилхолина в мембраны эритроцитов с последующим изменением их параметров является вполне закономерным. Между эритроцитами и адсорбированными на их поверхности липопротеидами происходит постоянный обмен холестерина, фосфолипидов [8]. Вероятно, экзогенный полиненасыщенный фосфатидилхолин и сфингомиелин замещают эндогенный насыщенный фосфатидилхолин и сфингомиелин не только в мембране гепатоцитов [8, 14], но и эритроцитов. Такое замещение приводит к повышению текучести клеточной мембраны и стимуляции связанных с мембраной ферментных систем, в частности кальцийзависимой АТФ-азы. Повышенная активность ферментов в сочетании с возможным снижением потребности в образовании эндогенных фосфолипидов способна облегчать утилизацию энергии процессами, участвующими в восстановлении клетки [8, 15]. Подобными процессами, вероятно, объясняются наблюдаемые при назначении эссенциальных фосфолипидов повышение пластичности эритроцитов, снижение жесткости и вязкости клеток, повышение их энергетического потенциала, отражаемого в увеличении количества дискоцитов, нарастании поляризуемости.
Встраиваясь в мембраны эритроцитов, эссенциальные фосфолипиды, очевидно, способны восстанавливать активность ферментов антиоксидантной системы, угнетать перекисное окисление липидов мембран, тем самым стабилизируя мембрану. Следствием этого, вероятно, является снижение склонности мембран эритроцитов к избыточному гемолизу и последующей агрегации клеток. Эссенциальные фосфолипиды, вероятно, способствуют и восстановлению отрицательного поверхностного заряда эритроцитов, который отражается скоростью движения эритроцитов к электродам.
Подобные позитивные изменения на фоне использования препарата «Фосфоглив» параметров эритроцитов приводят к уменьшению степени микроциркуляторных нарушений, уровня тканевой гипоксии, которая является важным фактором прогрессирования фиброза печени при острой токсической гепатопатии [8, 14, 15].
Заключение
Представленные выше данные позволяют сделать заключение, что в условиях острой лекарственной (индометациновой) токсической гепатопатии имеет место нарушение метаболического гомеостаза, что проявляется в изменении структурно-функциональных свойств эритроцитов, в первую очередь, белково-липидного спектра. При этом использование различных форм препарата «Фосфоглива» позволяет корригировать и нормализовывать представительность белков и липидов в мембране красных клеток крови. Максимальной эффективностью в условиях ОТПП обладает «Фосфоглив для инъекций», минимальной - «Фосфоглив», тогда как «Фосфоглив Форте» занимает промежуточное положение.
Полученные результаты диктуют необходимость апробирования данных форм препарата «Фосфоглив» в клинических исследованиях с целью разработки эффективных способов фармакокоррекции метаболических нарушений при острой токсической гепатопатии.
Рецензенты:
Калюжин О.В., д.м.н., профессор кафедры клинической иммунологии и аллергологии ГОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравразвития России», г. Москва;
Афанасьев Ю.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой внутренних болезней №1 ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный университет», г. Белгород.
Работа поступила в редакцию 10.11.2011.